α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法

α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0715
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：為易揮發試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2. 試劑五：臨用前取1支試劑五，加入1 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存4周；

3. 試劑六：臨用前取1支試劑六，加入1.5 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

4. 試劑七：臨用前取1支試劑七，加入1 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融（1支粉劑溶解后可做100T，為了延長使用時間，此產品多給1支粉劑）；

5. 試劑八：臨用前取1支試劑八，加入0.4mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

6. 工作液的配制：臨用前依次取8.05 mL試劑三、0.2 mL試劑四、1 mL試劑五、1.25 mL試劑六、0.5 mL試劑七（共11mL，約55T），充分混合待用，現用現配。

產品說明：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中，是三羧酸循環調控關鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔*A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺和輔*A生成琥珀酰輔*A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

1. 測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2. 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。

3. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

4. 測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。

5. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

實驗實例：

1. 取0.1g稗草進行樣本處理，將取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A4-A3=0.3243-0.3115=0.0128，ΔA空白=A2-A1=0，按樣本質量計算酶活得：

α-KGDH活性（U/g 質量）=1488.5×(ΔA測定-ΔA空白)÷W×2（稀釋倍數）=381.056 U/g 質量。

1. 取0.1g小鼠肝臟進行樣本處理，4 ℃ 11000g離心10min，取上清后按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A4-A3=1.2123-0.9623=0.2500，ΔA空白=A2-A1=0，按樣本質量計算酶活得：

α-KGDH活性（U/g 質量）=1488.5×(ΔA測定-ΔA空白)÷W=3721.25 U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Jianyun Yue,Changjian Du,Jing Ji,et al. Inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity afects adventitious root growth in poplar via changes in GABA shunt. Planta. July 2018;(IF3.06)

2. Xiao Li,Qi Zhao,Jianni Qi,et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018; (IF3.571)

參考文獻：
Park L C H, Calingasan N Y, Sheu K F R, et al. Quantitative α-ketoglutarate dehydrogenase activity staining in brain sections and in cultured cells[J]. Analytical biochemistry, 2000, 277(1): 86-93.
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