果膠裂解酶活性檢測試劑盒

果膠裂解酶（PL）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號: BC2640
規格: 50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液：將試劑一倒入試劑二于50℃水浴中溶解（期間可拿出振蕩數次）。該試劑易長菌，配制完成后可-20℃分裝保存，可保存12周。

產品說明：
果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，催化果膠分子鏈的消除裂解。來源比較廣泛，主要來源于微生物，在食品加工工業中提高果汁產量方面有重要意義，在減少環境污染和降低能源消耗方面也具有潛在的應用價值。果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰，測定235nm下吸光度的上升來表示果膠裂解酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、恒溫水浴鍋、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細胞、細菌或真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。（細菌、真菌等難以數量計算的微生物也可以稱取0.1g 細菌/真菌沉淀來進行前處理）

3. 培養液：直接測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長至235nm，蒸餾水調零。

2. 操作表：(在1.5mL離心管中)

三、果膠裂解酶活性計算

1. 按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr

1. 按照樣本質量計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每克組織每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷W

1. 按照細菌、真菌貨細胞數量計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每10⁴個細胞每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×N÷V樣總）÷T= 64.1×ΔA÷N

1. 按照培養液體積計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫升培養液每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T= 64.1×ΔA
ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數，5200 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.001L；V樣：反應體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min；10⁹：換算系數，1mol=10⁹nmol；N：細胞數量，以萬計。
注意事項：

1. 若A1測定管大于1.5或者ΔA大于0.5，將樣本粗酶液用蒸餾水稀釋后再進行測定。

2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應時間。

3. 空白管正常情況下變化不超過0.02。

實驗實例：

1. 取0.1g香蕉皮加入1mL提取液進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A2測定管-A1測定管=0.43-0.421=0.009，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0.217-0.217=0，按樣本質量計算酶活得：

PL活性（U/g 質量）= 64.1×ΔA÷W=5.526 U/g 質量。

1. 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1mL提取液冰浴超聲波破碎細胞，然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A2測定管-A1測定管=1.352-0.923=0.429，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0.217-0.217=0，按照樣本質量計算酶活得：

PL活性（U/g 質量）= 64.1×ΔA÷W=274.99 U/g 質量。
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