蔗糖磷酸化酶活性檢測試劑盒

蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC0450
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入15 mL蒸餾水，充分混勻。2-8℃可以保存4周；

2. 試劑四：臨用前取1瓶加入1.5 mL蒸餾水，充分混勻。分裝后-20℃保存，避免反復凍融，可以保存2周；

3. 試劑五：粉劑置于瓶內(nèi)玻璃管中。臨用前加入10 mL蒸餾水，充分混勻。-20℃分裝保存，避免反復凍融，可以保存4周；

4. 試劑六：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑六：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑六，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5. 試劑七：臨用前取1支加入0.7 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑七：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑七，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質(zhì)如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷。
SP能夠催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP⁺生成NADPH，導致340nm光吸收值增加。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、1mL石英比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質(zhì)量(g)︰提取液體積(mL)為1︰5-10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min ，取上清置于冰上待測。
2、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，3000rpm離心5min后棄上清；按照細胞或細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500-1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min ，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。若液體渾濁可離心后取上清測定。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一37℃預熱10min。

3. 操作表：

三、蔗糖磷酸化酶（SP）活性計算
(1) 按照蛋白濃度計算
酶活定義：37℃，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T =803.85×ΔA÷Cpr
(2) 按照樣本質(zhì)量計算
酶活定義：37℃，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=803.85×ΔA÷W
(3) 按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：37℃，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個）)÷T
= 803.85×ΔA÷細胞數(shù)量（萬個）
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：提取液體積，1mL ；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，2min；10⁹：1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 如果測定吸光值A(chǔ)＞1.5，建議用提取液稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進行測定。

實驗實例：

1. 
   

1. 
   

2. 稱取0.1 g土豆，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=（0.5620-0.4300）-（0.059-0.059）=0.132，按公式計算活性：

3. 
   

SP活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T =1061.1 U/g質(zhì)量

1. 
   

1. 
   

2. 稱取0.1 g黑米，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用1mL石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=（0.7290-0.6030）-（0.059-0.059）=0.126，按公式計算活性：SP活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1012.85U/g質(zhì)量

3. 
   

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