動(dòng)物組織中甲醛脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 輔酶

動(dòng)物組織中甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC4980

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入0.25 mL蒸餾水，充分混勻；用不完的試劑-20℃分裝保存兩周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑二工作液：根據(jù)試驗(yàn)所需用量，按照試劑二（μL）∶蒸餾水（μL）=1∶29比例配成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。試劑二工作液當(dāng)天配制當(dāng)天用完。

3、 試劑三：臨用前加入1.5 mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃分裝保存兩周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中，是一種將甲醛進(jìn)行轉(zhuǎn)換的氧化還原酶。甲醛脫氫酶可催化甲醛和NAD⁺產(chǎn)生NADH，在340nm處的吸光值會(huì)增加，測(cè)定340nm處的吸光值變化，可計(jì)算得到甲醛脫氫酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）=1∶5~10的比例（建議稱取0.1 g動(dòng)物組織，加入1 mL提取液），冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清（若上清不夠澄清，建議重復(fù)上述離心步驟）置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前將試劑一、試劑四置于37℃預(yù)熱10min。

3、 在1 mL石英比色皿中依次加入 100 μL 樣本、550 μL試劑一、250 μL試劑二工作液、50 μL試劑三、50 μL試劑四，立即充分混勻后于340nm處測(cè)定20s時(shí)的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或者培養(yǎng)箱中反應(yīng)5min，拿出迅速擦干測(cè)定5min20s時(shí)的吸光值A2，記錄 340nm 下20s時(shí)吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。

三、動(dòng)物組織中甲醛脫氫酶活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F=321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、如果測(cè)定吸光值A＞1.0或ΔA＞0.5，建議用提取液稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測(cè)定吸光值較低，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定。

2、試劑四有毒性，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)佩戴口罩手套等防護(hù)用具。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1 g小鼠心臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測(cè)。使用1mL石英比色皿按照測(cè)定步驟操作，計(jì)算ΔA=A2-A1=0.626-0.301=0.325，按公式計(jì)算小鼠心臟組織中甲醛脫氫酶活性：

FDH酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W×F=1045 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1 g小鼠肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清稀釋10倍置于冰上待測(cè)。使用1mL石英比色皿按照測(cè)定步驟操作，計(jì)算ΔA=A2-A1=0.224-0.136=0.088，按公式計(jì)算小鼠肝臟組織中甲醛脫氫酶活性：

FDH酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W×F=2829.6 U/g 質(zhì)量

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