吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測試劑盒 微量法

吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5385

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：易揮發試劑，用完及時擰蓋封口放回-20℃。

2、 提取液的配制：根據樣本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，現用現配，禁止提前配制。

3、 試劑三：臨用前取一支試劑三加入5.6mL試劑一，充分混勻。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。

4、 標準品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL NADH標準液。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以保存2周，避免反復凍融。臨用前取100μL的2 µmol/mL NADH標準液于EP管中，加入700μL蒸餾水充分溶解，配制成0.25μmol/mL的NADH標準液。現用現配。

產品說明：

吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉化為脯*酸，并且P5CR 還被發現能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸 (Thioproline) 的代謝過程。

硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫，并伴隨著NAD轉化為NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等液體：直接測定。(若溶液呈現渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至450nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2、操作表：

充分混勻，37℃反應顯色30min，取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中，測定在450nm處的吸光度。記作A_測定，A_對照，A_標準，A_空白。ΔA_測定=A_測定-A_對照，ΔA_標準=A_標準-A_空白。（標準管和空白管只需做1-2次。）

三、P5CR活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/mg prot）=(ΔA_測定×C_標準÷ΔA_標準) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準÷Cpr×F

(2) 按樣本質量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/g 質量）= (ΔA_測定×C_標準÷ΔA_標準) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準÷W×F

(3) 按細菌或細胞數目計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/10⁴ cell）= (ΔA_測定×C_標準÷ΔA_標準) ×V_樣÷（500÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=0.0167×ΔA_測定÷ΔA_標準×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

P5CR活性（U/mL）= (ΔA_測定×C_標準÷ΔA_標準) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準×F

C_標準: NADH標準液的濃度，0.25μmol/mL；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.02mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數目，500萬；10³：單位換算系數，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

1. 如果A_測定大于1.8或者?A_測定大于1，可以減少樣品量或者縮短反應時間；若?A_測定小于0.01，可以加大樣品量或者延長反應時間至1h或者更長時間。計算公式注意同步修改

實驗實例：

1、 稱取0.0993g橙子葉，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=A_測定-A_對照=0.318-0.288=0.03，ΔA_標準=A_標準-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算：

P5CR活性(U/g 質量)= 8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準÷W×F =8.333×0.03÷0.357÷0.0993=7.052 U/g 質量

2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=A_測定-A_對照=0.369-0.274=0.095，ΔA_標準=A_標準-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算：

P5CR活性(U/g 質量)= 8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準÷W×F =8.333×0.095÷0.357÷1.006=22.042 U/g 質量

3、 吸取0.02mL羊血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=A_測定-A_對照=0.299-0.146=0.153，ΔA_標準=A_標準-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算： 

P5CR活性(U/mL)= 8.333×ΔA_測定÷ΔA_標準÷W×F =8.333×0.153÷0.357=3.571 U/mL

參考文獻：

FENG Chang-Z, XIE Y H, CAO Y, et al. Expression, Purification and Physicochemical Characteristics of Pyrroline-5-Carboxylic Acid Reductase in Drosophila[J]. Chinese Journal of Biological Engineering, 2012, 32(6):8. 

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