抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測試劑盒 微量法

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5405

規(guī)格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入1.2mL試劑一，充分溶解，如果試劑溶解不充分，可將試劑加熱至50℃促進溶解。未用完的試劑2-8℃保存可以保存8周。

2、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水，充分溶解，未用完的試劑-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。一支試劑溶解后可以做100T，為了延長試劑盒使用時間，因此多給一支粉劑。

3、 試劑四：臨用前加入5.5mL蒸餾水溶解，未用完的試劑2-8℃保存可以保存4周。

4、 試劑五：臨用前根據樣本量按照試劑五：蒸餾水=1:9的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、 標準品：5μmol/mL 酚標準液。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標準液于EP管中，加入300μL蒸餾水充分溶解，配制成1.25 μmol/mL的酚標準液。

產品說明：

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是破骨細胞的特征性酶，TRAP參與骨基質中固體鈣磷礦化底物的降解，其表達和分泌與破骨細胞功能密切相關。

在酒石酸存在的情況下，抗酒石酸酸性磷酸酶的活性不被抑制，而其他的酸性磷酸酶的活性則會受到抑制。酸性條件下，抗酒石酸酸性磷酸酶催化PN PP生成對硝 基*酚。對硝基*酚在堿性條件下呈黃色，可以在400nm波長下檢測吸光度。產物黃色越深，說明抗酒石酸酸性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。。

3、液體：直接測定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至400nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2、操作表：（在96孔板或者EP管中加入下列試劑）

混勻后，測定在400nm處的吸光度，記作A_測定，A_對照，A_標準，A_標準空白。?A_測定=A_測定-A_對照，?A_標準=A_標準-A_標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次。）

三、TRAP活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

TRAP活性（U/mg prot）=(?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=20.83×?A_測定÷?A_標準÷Cpr×F

(2) 按樣本質量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

TRAP活性（U/g 質量）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=20.83×?A_測定÷?A_標準÷W×F

(3) 按細菌或細胞數目計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

TRAP活性（U/10⁴ cell）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=20.83×?A_測定÷?A_標準÷N×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

TRAP活性（U/mL）= (?A_測定×C_標準÷?A_標準) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=20.83×?A_測定÷?A_標準×F

C_標準:酚標準液，1.25 μmol/mL ；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.01mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，60min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數目，500萬；10³：單位換算系數，1μmol/mL=10³nmol/mL；N：細胞或細菌數量，以萬計；F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

1、 如果測定的吸光值或?A_測定大于1.5，可以對樣本用蒸餾水進行稀釋或者縮短37℃酶促反應時間；?A_測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應時間。最終計算時同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.1057g兔子腎臟組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.824-0.096=0.728，?_標準=A_標準-A_標準空白=0.820-0.065=0.755，帶入公式計算：

TRAP活性（U/g 質量）=20.83×?A_測定÷?A_標準÷W×F=190.02 U/g 質量

2、 稱取0.1000g竹子葉，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，將上清稀釋4倍按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.900-0.089=0.811，?_標準=A_標準-A_標準空白=0.820-0.065=0.755，帶入公式計算：

TRAP活性（U/g 質量）=20.83×?A_測定÷?A_標準÷W×F=895.0 U/g 質量

3、 吸取0.01mL人血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.181-0.161=0.020，?_標準=A_標準-A_標準空白=0.820-0.065=0.755，帶入公式計算： 

TRAP活性（U/mL）=20.83×?A_測定÷?A_標準×F=0.552 U/mL

參考文獻：

[1] Megat R, Wahab A, Dasor M M, et al. Crevicular tartrate resistant acid phosphatase activity and rate of tooth movement under different continuous force applications[J]. African journal of pharmacy and pharmacology, 2011, 5(20):2213-2219.

[2] Natasˇa Mitic′, Mohsen Valizadeh, Eleanor W.W. Leung, et al. Human tartrate-resistant acid phosphatase becomes

an effective ATPase upon proteolytic activation [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics 439 (2005) 154–164.

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