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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5340-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1018
010-50973130
產品分類
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L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5340
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體12 mL×1瓶 | |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（9T）的比例配制試劑二溶液，現用現配；
2、 試劑三：臨用前加入8 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
3、 標準品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標準溶液，2-8℃可保存12周；
產品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據此可計算乳酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養箱、蒸餾水。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
2. 細胞/細菌：按照細胞/細菌數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞/細菌加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞/細菌（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，波長調至450nm，蒸餾水調零。
2、 標準液的稀釋：將100μmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.020、0.01μmol/mL的標準溶液備用。
3、標準品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 100 | 50 | 950 | 5 |
2 | 5 | 100 | 700 | 0.625 |
3 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
6 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
7 | 0.039 | 200 | 200 | 0.020 |
8 | 0.020 | 200 | 200 | 0.010 |
實驗中每個標準管需50µL標準溶液
3、加樣表：（按順序將下列試劑加在EP管中）
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
樣本（μL） | 50 | 50 | - | - |
標準品（μL） | - | - | 50 | - |
蒸餾水（μL） | - | 50 | - | 50 |
試劑一（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
試劑二（μL） | 50 | - | 50 | 50 |
試劑三（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
試劑四（μL） | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混勻，于37℃水浴鍋/恒溫培養箱避光準確反應30min。 | ||||
蒸餾水（μL） | 450 | 450 | 450 | 450 |
混勻后，取出全部反應液到1mL比色皿中，于450nm處測定吸光值，分別記為A測定管，A對照管，A標準管，A空白管，計算ΔA測定=A測定管-A對照管；ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設置一個對照管，空白管和標準曲線只需測定1-2次。 | ||||
三、乳酸含量的計算
1、標準曲線的繪制
以各標準溶液濃度為x軸，以其對應的吸光值（ΔA標準）為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將
ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）。
2、乳酸含量計算
（1）按照蛋白含量計算
L-LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）=x÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
L-LA含量（μmol/g 質量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W
（3）按照細胞/細菌數量計算
L-LA含量（μmol/104 cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N
（4）按照液體體積計算
L-LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x
V樣本：加入的樣本體積，0.05mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細胞/細菌數量，104個；V液體：液體樣本體積，0.1mL。
注意事項：
1. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。
2. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取樣本。
實驗實例：
1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋兩倍，按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.972-0.092= 0.880，根據標準曲線y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，計算x=0.6477，按樣本質量計算含量得：
L-LA含量（μmol/g 質量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數（2）=10.493 μmol/g質量。
2、 取0.1063g紅薯根加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計算ΔΔA測定=A測定管-A對照管=0.124-0.099=0.025，根據標準曲線y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，計算x=0.0213，按樣本質量計算含量得：
L-LA含量（μmol/g 質量）=1.1875×x÷W=0.2382μmol/g質量。
3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.587-0.095=0.492，根據標準曲線y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，計算x=0.3634，按照液體體積計算含量得：
L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=4.748 μmol/mL。
參考文獻：
Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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