甲基檸檬酸合酶活性檢測試劑盒 微量法

甲基檸檬酸合酶（MCS）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5865

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

2、 試劑五：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

產品說明：

甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環的調節。

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產生甲基檸檬酰*A，進一步水解產生甲基檸檬酸；該反應促使DTNB轉變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據此可以計算MCS活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）和10μL試劑一，進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液和10μL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 試劑二置于37℃水浴中預熱15min。

3、 操作表：在微量比色皿/96孔板中依次加入（適用于測定動物組織樣本）

4、 操作表：在微量比色皿/96孔板中分別加入（適用于測定微生物及植物組織樣本）

三、甲基檸檬酸合酶（MCS）計算公式

1. 使用96孔板測定（動物組織樣本）：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=700.28×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=707.28×ΔA÷W

ε：TNB摩爾消光系數，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，0.6cm；V反：反應體系體積，0.2mL； V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.007mL；V提取：加入提取液及試劑一的體積，1.01mL；T：反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

2. 使用96孔板測定（微生物及植物組織樣本）：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=20.42×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=20.63×ΔA÷W

（3）按細菌/細胞計算：

酶活定義：每10⁶個細菌/細胞在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V樣）÷T = 20.63×ΔA÷N

ε：TNB摩爾消光系數，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，0.6cm；V反：反應體系體積，0.2mL； V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.040mL；V提取：加入提取液及試劑一的體積，1.01mL；T：反應時間，30min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以10⁶計。

3. 使用微量比色皿測定：

將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm（微量比色皿光徑）進行計算即可。

注意事項：

1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（約1mg/mL），故測定蛋白濃度時需要同時測定提取液的蛋白濃度。

4. 當樣本ΔA＜0.01時，可適當延長酶促反應時間或增大樣本量后測定，注意同步修改計算公式。

5. 當樣本ΔA>1或A>1.5時，可將樣本用提取液適當稀釋后測定，注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 取0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進行冰浴勻漿，取上清用后，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.665-0.349）-（0.261-0.251）=0.306，按樣本質量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質量）= 707.28×ΔA÷W =2357.60 U/g 質量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.362-0.262）-（0.255-0.261）=0.106，按樣本質量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質量）= 20.63×ΔA÷W =18.72 U/g 質量。

3、 取0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.291-0.252）-（0.261-0.249）=0.027，按樣本質量計算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質量）=20.63×ΔA÷W =5.50 U/g 質量。

參考文獻：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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