果糖-1,6-二磷酸含量檢測試劑盒 糖酵解

果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2240
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一支加入0.5 mL蒸餾水，充分溶解后待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2. 標準品：臨用前加入1176μL 蒸餾水充分溶解，配制成50μmol/mL果糖-1,6-二磷酸標準溶液，2-8℃可以保存4周。

產品說明：
果糖1,6-二磷酸（fructose-1,6-diphosphate, FDP）是糖酵解過程中的一種重要的中間產物，對多種酶具有調節作用，具有改善細胞能量代謝、增加能量利用、抗心律失常及抗組織過氧化等作用，廣泛應用于臨床醫藥。
醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，產物與2,4-二* 苯 肼在酸性介質中反應生成2,4-二*苯腙，在堿性溶液中呈紅棕色，在540 nm處有特征吸收峰。


注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水和EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。
二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min 以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。

2. 將50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸標準液用蒸餾水倍比稀釋為1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的標準溶液備用。

3. 標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需100µL標準溶液。

1. 樣本測定：(在1.5 mL離心管中操作）

三、FDA含量計算

1. 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。

1. FDP含量的計算：

（1）按樣本質量計算
FDP含量（µg/g 質量）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W
（2）按細胞數量計算
FDP含量（µg/10⁴ cell）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N
（3）按液體體積計算
FDP含量（µg/mL）=x×（V上清+V提取液二）×M÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=4441.25x
V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：提取液一的體積，1mL；W：樣本質量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子質量，340；V液體：液體樣本體積，0.1mL；N：細胞數量，以萬計。
注意事項：
當ΔA測定大于0.5時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。
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