線粒體異檸檬酸脫氫酶測試盒 三羧酸循環

線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC2160
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液二：易揮發試劑，用完后蓋緊蓋兒后及時放回-20℃保存；

2. 試劑三：臨用前加入0.75 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3. 標準品：10 mg α-酮戊二酸。臨用前加入684 μL蒸餾水，配成100 μmol/mL標準液，2-8℃保存8周；

4. 工作液的配制：臨用前根據用量將試劑一、試劑二按1:1比例混合，現配現用。

產品說明：
線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中，與線粒體基因表達及線粒體其他的功能有關。異檸檬酸脫氫酶在生物體內有兩種存在形式，以NAD為輔酶的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶，和以NADP為輔酶的NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶。
異檸檬酸脫氫酶的主要功能，是在體內三羧酸循環中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，將NAD還原成NADH，通過測定α-酮戊二酸的生成量，可以計算出線粒體異檸檬酸脫氫酶活力高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
低溫離心機、可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用提取液三稀釋

上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數。

1. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

2. 測定蛋白濃度時，由于試劑一本身含有蛋白（約1mg/mL），所以測定時需扣除此部分蛋白。

3. 附：使用樣本重量計算公式

A、上清（胞漿）中ICDHm活力計算：
按樣本質量計算
酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=25.25×x÷W
V提取：加入提取液體積，1.515mL；V樣：加入上清液體積，0.2mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1h=60min；10³：單位換算系數，1μmol =10³nmol。
B、沉淀（線粒體）中ICDHm活力計算：
按樣本質量計算
酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=10.1×x÷W
V提取：沉淀重懸時加入提取液體積，0.606mL；V樣：加入上清液體積，0.2mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1h=60min；10³：單位換算系數，1μmol =10³nmol。
C、樣本ICDHm總活力計算：
樣本ICDHm總活力即為上清（胞漿）中ICDHm活力與沉淀（線粒體）中ICDHm活力之和。
按樣本質量計算：ICDHm（U/g 質量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W
實驗實例：

1. 取0.3g小鼠腎臟加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液，分別按操作步驟檢測，測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.767-0.475=0.292，帶入標準曲線y=1.0917x+0.0471計算相應的x值，按樣本質量計算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質量）=25.25×x÷W=0 U/g質量
線粒體中ICDHm活性（U/g質量）=10.1×x÷W=7.55 U/g質量
樣本總ICDHm（U/g 質量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W=7.55 U/g質量。
 

1. 取0.3g小化眉加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，上清液稀釋2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液稀釋2倍，分別按操作步驟檢測，測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.635-0.487=0.148，帶入標準曲線y=1.0917x+0.0471計算相應的x值，按樣本質量計算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質量）=25.25×x÷W×2=15.49U/g質量
線粒體中ICDHm活性（U/g質量）=10.1×x÷W×2=2.28 U/g質量
樣本總ICDHm（U/g 質量）=25.25×x÷W×2+10.1×x÷W×2=15.49 U/g質量。
相關發表文獻：
Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)
參考文獻：
Igamberdiev A U, Gardestr?m P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.
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