檸檬酸合酶（CS）活性檢測試劑盒 輔酶

檸檬酸合酶（CS）活
性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號: BC1060
規格: 25T/12S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入500 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑六：臨用前加入1.5 mL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產品說明：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環第一個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔*A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使DTNB轉變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸光值。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、可調節移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL提取液和10μL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 將勻漿液600g，4℃離心5min。將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

3. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS。

4. 在沉淀中加入200μL試劑一和2μL 試劑二，反復吹打充分混勻，用于CS測定，并用于蛋白濃度測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱10min左右（保證無沉淀）。

3. 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入

將上述試劑按順序加入1mL玻璃比色皿中，加試劑六的同時開始計時，記錄412nm波長下10秒時的初始吸光度A1，之后迅速將比色皿連同反應液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準確反應2分鐘；迅速取出比色皿并擦干，412nm下記錄2分10秒時的吸光度A2，并計算測定管的ΔA1=A2-A1，對照管的ΔA1’=A2’-A1’，ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三、CS活性計算
按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：37℃或25℃下每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=1050×ΔA÷Cpr
ε：TNB的消光系數，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應體系總體積，1mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.035mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本的蛋白濃度，mg/mL。
注意事項：
1、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
5、附：使用樣本鮮重計算公式
單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS上清（U/g 質量）=ΔA上清÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 質量）=ΔA沉淀÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 質量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清測定值；ΔA沉淀：沉淀測定值；ε：TNB的消光系數，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應體系總體積，1mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.035mL；V提取：提取液體積，1.01mL；V樣總：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應時間，2min；W：樣本質量，g。
實驗實例：
取0.1g小鼠心臟樣本加入1mL提取液和10μL試劑二進行勻漿研磨，取上清后再離心，取上清，取沉淀后加入200μL試劑一和2μL試劑二，之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測吸光度后計算上清中：ΔA1= A2-A1=1.213-0.7=0.513，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.513；沉淀中：ΔA 1=A2-A1=0.447-0.133=0.314，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.314，按樣本質量計算酶活得：
CS（U/g 質量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
= 1061×0.513÷0.1+212×0.314÷0.1=6108.7U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

參考文獻：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
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