Caspase-6活性測定試劑盒 常量法

Caspase-6活性檢測試劑盒說明書

比色法

貨號：BC3860

規格：20T、50T、100T

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：分裝-20℃保存。

2、 試劑二：分裝-20℃保存。

3、 標準品：pNA標準溶液，5 mmol/L。標準溶液在4℃條件下為渾濁狀態，溶解即可變為澄清狀態，不影響使用。

4、 標準品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二，充分混勻待用。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）。

產品說明：

Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導細胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關鍵調節蛋白PARP，剪切核膜上關鍵蛋白Lamin A，其對于Lamin A的識別位點是VEID。

本試劑盒測定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，釋放出游離的硝基苯胺pNA，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰，采用可見光光度比色法測定。其吸光度值對應于Caspase-6的水解活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、培養細胞：先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（約10⁶個）加100 μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震蕩重懸沉淀，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL試劑二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。 

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至405nm，蒸餾水調零。

2、 臨用前用標準品稀釋液將5 mmol/L pNA標準品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標準溶液待用。

3、 樣本測定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）

三、Caspase-6活性計算

1. 標準曲線的建立：

根據標準管的濃度（x，μmol/L）和ΔA標準（y，減去濃度為0的空白管）做標準方程。將ΔA測定代入標準方程得到x（μmol/L）。

2. 按酶活性增加百分比計算

Caspase-6活性增加百分比=（實驗處理組A測定-A空白管）/（實驗對照組A測定-A空白管）×100%

該方法簡單可靠，可粗略反應酶活性情況。

3. 按酶活計算

參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37℃一個小時內可以剪切1nmol pNA底物產生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase酶活性。

Caspase-6活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V反總：反應體系總體積，0.1mL=10^-4L；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應時間，h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；10³：單位換算系數，1μmol =10³nmol。

注意事項：

1、由于試劑二中含有還原劑（DTT），建議將樣品用水稀釋2倍后，用Bradford法測定蛋白濃度，以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。

2、Caspase活性測定值低最常見的原因是細胞未發生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間不恰當。誘導凋亡時，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高。建議設置不同劑量和時間點如0、2、4、8、16、24小時，以檢測最佳的觀察點。

3、所測樣本的值高于標準曲線上限，可用試劑二稀釋樣本后重新測定。

4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2，此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜，但酶活性較強時，孵育時間過長將導致反應失去線性關系。

參考文獻：

[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

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