NADP磷酸酶(NADPase)活性檢測(cè)試劑盒 輔酶

NADP磷酸酶（NADPase）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
可見(jiàn)分光光度法
貨號(hào): BC1110
規(guī)格: 50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：用時(shí)加入1.5 mL試劑一充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 試劑三：用時(shí)加入20 mL雙蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

3. 試劑四：用時(shí)加入20 mL雙蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液。將標(biāo)準(zhǔn)品20倍稀釋，即取 0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液加9.5 mL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液。

5. 定磷試劑的配制：按H₂O：試劑三：試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
產(chǎn)品說(shuō)明：
NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)催化NADP⁺降解為NAD⁺的酶，與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。
NADPase能夠催化NADP⁺水解為NAD⁺和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)測(cè)定NADPase活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿、勻漿器/研缽和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒(méi)有一點(diǎn)磷，若試管放過(guò)磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來(lái)水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。

2. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1肝加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.410-0.385=0.025，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.365-0.005=0.360，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：NADPase (U/g質(zhì)量)=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=0.125×0.025÷0.360÷0.1=0.087 U/g質(zhì)量。

2. 取0.1g狗尾巴草（塊根)加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A測(cè)定-A對(duì)照=0.510-0.107=0.403，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.365-0.005=0.360，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：NADPase (U/g質(zhì)量) =0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=0.125×0.403÷0.360÷0.1=1.399 U/g質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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