NAD激酶(NADK)活性檢測試劑盒 輔酶

NAD激酶（NADK）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1030
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：用時加入3.75mL雙蒸水，充分溶解，可分裝保存，-20℃保存兩周，禁止反復凍融；臨用前取出一支稀釋100倍使用。

2. 試劑四：用時加入2.5 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

3. 試劑五：用時每瓶加入3 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

4. 試劑六：用時加入6 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

5. 試劑七：用時加入6 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃避光保存；

6. 試劑八：液體置于試劑瓶內EP管中。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解，可分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

7. 試劑十：自備95%乙醇；

8. 標準品：加入1.9 mL蒸餾水，即得2 μmol/mL NADP標品。臨用前稀釋100倍得20 nmol/mL NADP標準溶液備用。

產品說明：
NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是目前所發現的生物體內能夠催化NAD⁺磷酸化生成NADP⁺的酶，可催化NAD(H)以ATP或無機*[poly(P)]作為磷酰基供體進行磷酸化反應，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調節NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。


NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；NADPH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT），通過其在570nm的吸光值大小可反映出NADK活性的大小。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、無水乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

注意事項：

1. 樣本的處理必須在0℃-4℃中操作完成，以防止酶變性失活。建議在正式實驗前，選取差別較大的兩個樣本進行預實驗。

2、試劑三、四、五、六、七、八在測定過程中都必須在冰上放置。
3、當初始吸光值大于0.6時，建議將樣本用PBS稀釋后測量。
4、若測量樣本數量過多，可以將試劑二、五、六、七按比例配成工作液使用。
實驗實例：

1. 取0.1大鼠腎臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，測得A測定=0.455，A對照=0.213，計算ΔA測定=A測定-A對照=0.455-0.213=0.242，帶入標準曲線y=0.1662x-0.0343，計算x=（0.242+0.0343）/0.1662=1.66，按樣本質量計算酶活得：

NADK（U/g 質量）=0.067×x÷W×稀釋倍數=0.067×1.66÷0.1×2=2.22 U/g 質量。

1. 取小鼠血漿直接檢測，測得A測定=0.131，A對照=0.094，計算ΔA測定=A測定-A對照=0.131-0.094=0.037，帶入標準曲線y=0.1662x-0.0343，計算x=（0.037+0.0343）/0.1662=0.429，按血漿體積計算酶活得：

NADK（U/mL）=0.067×x =0.067×0.429=0.028 U/mL。
參考文獻：

1. Pollak N, Niere M, Ziegler M. NAD kinase levels control the NADPH concentration in human cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(46): 33562-33571.

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