NADH氧化酶（NOX）活性檢測試劑盒 輔酶系列

NADH氧化酶（NOX）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC0630
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
試劑六：臨用前加入9 mL雙蒸水，用不完的試劑-20℃分裝保存。
產品說明：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD⁺。該酶不僅參與NAD⁺的再生，而且與免疫反應密切相關。
NOX能夠將NADH氧化為NAD⁺，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：“具體操作步驟詳見“產品資料"附件"
注意事項：
1、粗酶液的提取必須在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶變性失活。
2、比色皿中反應液的溫度最好保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、實驗時，試劑六樣本在冰上放置，以免變性和失活。
5、推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
6、附：使用樣本鮮重計算公式：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX上清活性（U/g 質量）=ΔA1÷0.01×V反總÷(W÷V提取×V樣)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 質量）=ΔA2÷0.01×V反總÷(W÷V樣總×V樣)÷T=505×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 質量）= NOX上清+ NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
 ΔA1：上清測定值；ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應總體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V提取：
加入試劑一體積，1.01mL；V樣總：沉淀重懸體積，0.202mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1min。
實驗實例：

1. 取0.1g肺部樣本進行樣本處理，按照測定步驟操作，測得ΔA1=ΔA測定-ΔA對照=（0.841-0.094）-（0.956-0.849）=0.64，ΔA2=ΔA測定-ΔA對照=(0.945-0.471)-(1.009-0.982)=0.447，按樣本質量計算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.64÷0.1=16160
NOX沉淀活性（U/g 質量）=505×ΔA2÷W=505×0.447÷0.1=2257.35
NOX活性（U/g質量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.64÷0.1+505×0.447÷0.1=16160+2257.35=18417.35 U/g 質量。

1. 取0.1g葉片樣本進行樣本處理，按照測定步驟操作，測得ΔA1=ΔA測定-ΔA對照=（0.875-0.812）-(0.903-0.888)=0.048，ΔA2=ΔA測定-ΔA對照=（0.919-0.868）-（0.91-0.879）=0.02，按樣本質量計算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.048÷0.1=1212
NOX沉淀活性（U/g 質量）=505×ΔA2÷W=505×0.02÷0.1=101
NOX活性（U/g 質量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.048÷0.1+505×0.02÷0.1=1313 U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Dou S, Liu S, Xu X, et al. Octanal inhibits spore germination of Penicillium digitatum involving membrane peroxidation[J]. Protoplasma, 2017, 254(4): 1539-1545.

2. Liu P, Zhang H M, Hu K, et al. Sensory plasticity of carotid body is correlated with oxidative stress in paraventricular nucleus during chronic intermittent hypoxia[J]. Journal of cellular physiology, 2019, 234(8): 13534-13543.

3. Yongtao Du,Mengjie Zhao,Changtao Wang,et al. Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress. BMC Plant Biology. December 2018;(IF3.67)

4. Youqiang Xu,Chunyan Xu,Xiuting Li,et al. A combinational optimization method for efficient synthesis of * by the recombinant Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal. January 2018;(IF3.371)

5. Weida Li,Kai Wang,Nanfang Jiang,et al. Antioxidant and antihyperlipidemic activities of purified polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Applied Phycology. April 2018;(IF4.784)

參考文獻：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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