亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒 抗氧化

亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC4340

規格：50T/24S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入7 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。

2、標準品：9 µmol/mL的亞鐵離子標準液。

產品說明：

亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe²⁺）氧化為三價鐵離子（Fe³⁺），從而三價鐵與轉鐵蛋白結合，參與細胞鐵釋放。

以一定濃度的Fe²⁺ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe²⁺ 被氧化為Fe³⁺，Fe²⁺ 與菲咯嗪形成有色復合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計算出未被氧化的Fe²⁺ 的含量，進而得出被氧化的Fe²⁺ 的含量，可通過Fe²⁺ 被氧化的速率來反映亞鐵氧化酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照質量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。

2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至562 nm，蒸餾水調零。

2、 標準液的稀釋：將9 µmol/mL的亞鐵離子標準液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標準溶液備用。

3、 標準液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標準管需100µL標準溶液。

4、 操作表：在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑：

三、亞鐵氧化酶活性計算

1、 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA測定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。

2、 亞鐵氧化酶活性的計算：

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2）按照樣本質量計算

酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/g質量）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N

（3）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T ×N= 1.667x×N

V試劑二：加入的試劑二體積，0.1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間：3 min；N：稀釋倍數。

注意事項：

1、當A測定低于0.1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。

實驗實例：

1、 取0.1g脾臟，進行樣本處理，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定=（A無基質管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.976-0.005）-（0.996-0.047）=0.022，帶入標準曲線y = 0.0027x + 0.0036，計算x=6.815，按照樣本質量計算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/g質量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×6.815÷0.1=113.603 U/g質量。

2、 取兔血清，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定=（A無基質管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.976-0.005）-（0.469-0.009）=0.511，帶入標準曲線y = 0.0027x + 0.0036，計算x=187.926，按照液體體積計算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×187.926=313.273 U/mL。

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