肝脂酶（HL）檢測試劑盒 脂肪酸代謝

肝脂酶（HL）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC2380
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
1、試劑三：臨用前加入30 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的 2-8℃保存8周；
2、試劑四：臨用前取1瓶加入2 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑可-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；
3、標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入6.94 mL丙 酮，配成10 μmol/mL α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分溶解待用，用不完的-20℃保存4周。
產(chǎn)品說明：
肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一種脂肪分解酶，在肝實質(zhì)細(xì)胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細(xì)胞表面和竇周間隙腔面的肝細(xì)胞微絨毛表面，可水解各種脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各種脂蛋白顆粒的大小和密度發(fā)生變化，當(dāng)血漿中的HL及其活性增高時，可導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。
肝脂酶水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍(lán)B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595 nm有特征吸收峰，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與肝脂酶活性成正相關(guān)。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、1 mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、EP管、 丙 酮、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰試劑一體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取樣本約0.1g，加入1mL試劑一），加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000 g離心10 min，取上清待測。
2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）︰試劑一體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后于4℃，10000g離心10 min，取上清待測。
3、血清/血漿：直接檢測。（若液體有渾濁則離心后進(jìn)行測定）
二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至595 nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 將試劑一在30℃預(yù)熱20 min以上。

3. 將10 μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用試劑一稀釋為1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1. 操作表：(在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑)

三、HL酶活計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（y，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

1. HL酶活的計算：

（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。
HL活性（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。
HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.1x÷W
（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算
酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。
HL活性（U/10⁴ cell）=x×V樣÷（V樣×N÷V樣總）÷T=0.1x÷N
（4）按液體體積計算
酶活定義：每毫升血清/血漿每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。
HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.1x
V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入試劑一體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計。
注意事項：

1. 若樣本為動物肝臟，建議將樣本用試劑一稀釋25倍以上再進(jìn)行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 若樣本為肥胖型動物血清或血漿，建議將樣本用試劑一稀釋5倍以上再進(jìn)行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 當(dāng)ΔA大于0.8時，建議將樣本用試劑一稀釋后再進(jìn)行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1. 取0.1g大鼠肝臟，進(jìn)行樣本處理，取上清稀釋48倍后按照操作步驟進(jìn)行操作，測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.713-0.001=0.712，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.6381x - 0.0005，計算x=1.1166，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×48=53.597 U/g 質(zhì)量。

2. 取火雞血清稀釋12倍后按照操作步驟進(jìn)行操作，測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.572-0.003=0.569，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.6381x - 0.0005，計算x=0.892，按照液體體積計算酶活得：HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T×12=1.071 U/mL。

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