結合態淀粉合成酶(GBSS)活性檢測試劑盒

結合態淀粉合成酶（GBSS）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3290
規格：25T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取試劑二A加入8 mL試劑一，緩慢加熱，逐漸升溫使其溶解，冷卻后加入試劑二B和試劑二C混合溶解，這樣可以分兩批配制并且測定，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

2. 試劑三：臨用前試劑三B加入試劑三A溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

3. 試劑四：臨用前先離心，取7 μL試劑四加入2.24 mL溶解好的試劑三混合備用（約14T），現用現配，也可根據樣本量按比例配制。

4. 試劑五：臨用前取試劑五B和試劑五C加入試劑五A中溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

5. 試劑六：臨用前取1支加入208 μL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

6. 試劑七：臨用前加入2mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存8周，避免反復凍融。

產品說明：
GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應，主要負責直鏈淀粉的合成。
GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時生成ADP；進一步通過反應體系中添加的丙 酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP⁺還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應生成的ADP數量呈正比，通過340nm下測定NADPH的增加量，可以計算GBSS活性。


注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 在EP管中按順序加入下列試劑

混勻后立即在340nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。
注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。
三、GBSS活性計算
1、按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
2、按照樣本質量計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS活性（U/g 質量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V測：測量體積，0.78mL；V反總：反應體積，0.62mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；T：反應時間，20min；ε：NADPH消光系數，6.22×10^-3mL/(nmol^.cm)；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
實驗實例：

1. 取0.1g肝臟加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A2-A1=0.19-0.178=0.012，按樣本質量計算：GBSS活性（U/g 質量）=43.2×ΔA÷W=5.184 U/g 質量。

2. 取0.1g柳樹加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A2-A1=1.919-1.915=0.004，按樣本質量計算：GBSS活性（U/g 質量）=43.2×ΔA÷W=1.728 U/g 質量。

參考文獻：

1. Jiang H, Dian W, Wu P. Effect of high temperature on fine structure of amylopectin in rice endosperm by reducing the activity of the starch branching enzyme[J]. Phytochemistry, 2003, 63(1): 53-59.

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