ADPG焦磷酸化酶(AGP)活性檢測試劑盒 淀粉

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0430
規格：25T/12S、50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

25T溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前將試劑二A加入5mL試劑二B充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2. 試劑三：臨用前取1支加1.5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3. 試劑四：臨用前加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存四周，避免反復凍。

4. 試劑五：臨用前加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存四周，避免反復凍。

50T溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二A加入5mL試劑二B充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

2. 試劑三：臨用前取1瓶加3 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

3. 試劑四：臨用前取1支加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

4. 試劑五：臨用前取1支加入500μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

產品說明：
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）與ATP反應生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
AGP催化的逆向反應生成G-1-P，在反應體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算AGP活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 在EP管中按順序加入下列試劑

迅速混勻后在340nm波長下測定10s吸光值A1和130s吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。
三、AGP活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。
AGP活性（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（Cpr×V樣本）=380.5×ΔA÷Cpr
（此法需要自行測定粗酶液蛋白質濃度）

1. 按照樣本質量計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
AGP活性（U/g 質量）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（W×V樣本÷V提取）=380.5×ΔA÷W
T：反應時間，15min；ε：NADPH消光系數，6.22×10^-3mL/nmol/cm；V反總：反應總體積，0.71mL；d：石英比色皿光程，1cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；W：樣本質量，g。
注意事項：
如果一次性測定樣本較多，可將試劑一、二按比例配成混合液1，將試劑一、三、四和五按比例配成混合液2。
若測定數值較小，可以加大樣本量或者延長第二步反應時間。
實驗實例：

1. 取0.1g柳樹葉片加入1mL提取液冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A2-A1=0.55-0.491=0.059，按樣本質量計算酶活得：AGP活性（U/g 質量）=380.5×ΔA÷W=224.495 U/g 質量。

參考文獻：

1. Baroja-Fernández E, Zandueta-Criado A, Rodr??guez-López M, et al. Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L)[J]. FEBS letters, 2000, 480(2-3): 277-282.

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