蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測試劑盒 微量法

提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制，請勿一次性全部混合。

若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配置成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時(shí)間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙 酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：若測定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙 酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙 酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙 酮，注意同步修改計(jì)算公式）。

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

操作表：（建議在2mL的EP管中操作）

按照樣本蛋白濃度計(jì)算：

按照樣本質(zhì)量計(jì)算：

按照液體體積計(jì)算：

按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

若樣本ΔA測定<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測定，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

可使用BCA法測定蛋白濃度。

取100μL馬血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定-A對照=0.113-0.047=0.066，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本液體體積計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mL）=2.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.529μmol/mL。

取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定-A對照=0.261-0.105=0.156，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =1.207μmol/g 質(zhì)量。

取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定- A對照=0.123-0.070=0.053，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.788μmol/g 質(zhì)量。