羊外周血單核細胞分離液試劑盒

羊外周血單核細胞分離液試劑盒
貨號：P5290
規格：2×200ml/KIT
保存 ：室溫避光儲存，有效期少 2 年。

羊外周血單核細胞分離液試劑盒

規格：4×200 ml/kit
保存：本產品對光敏感，應該室溫避光儲存，保質期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。 組成：
試劑A 200mL
試劑D 200mL
全血及組織稀釋液 200mL
細胞洗滌液 200mL

操作步驟：
1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。
2. 取一支無菌離心管，先加入試劑A，再加入試劑D，使兩者形成梯度界面（試劑A：試劑D的體積比為3：2，如稀釋后的血液樣本小于5ml，則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D；如稀釋后的血液樣本大于5ml，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等），兩種試劑的分層一定要清晰。
3. 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因為兩者的密度差異，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多，加樣的時間較長，在離心之前出現紅細胞成團下沉屬正常現象）
4. 室溫，水平轉子500~800g，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時間越長，分離條件需自行摸索，離心轉速大不超過1000g）。
5. 離心后將出現明顯的分層： 層為血漿層；第二層為白色單核細胞層；第三層為透明試劑D液層；第四層為半透明試劑A液層；第五層為紅細胞層（如圖示）。
6. 小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細胞層到另一無菌的15ml離心管中，加入10mL細胞洗滌液或PBS，顛倒混勻，250g，離心10min。
7. 棄上清，5mL的細胞清洗液或PBS重懸細胞，250g，離心10min。
8. 重復步驟7
9. 棄上清，細胞重懸備用。
10. 差異貼壁法純化細胞：用單核細胞培養基以10
6個/ml的密度重懸細胞，將細胞鋪于細胞板或細胞瓶中，置于細胞培養箱中進行貼壁培養。
1) 2~4 h內貼壁的為單核細胞。
2) 10~24 h內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞 。
3) 不貼壁的為淋巴細胞。
根據不同細胞的貼壁時間存在差異，以達到簡單純化單核細胞的目的。此法成本低，操作簡便。如需獲得高純度的目的細胞則需選用免疫磁珠分選或者是應用流式技術分選細胞。
血漿層
單核細胞層
試劑 D
試劑 A
紅細胞層
分層示意圖

注意事項：
A. 開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物污染。。
B. 分離液使用時應始終保持室溫（18℃~25℃），如室內溫度較低，可將分離液預熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會導致白膜層中紅細胞污染加重。
C. 血液樣本為新鮮的抗凝血（采血2 h以內），為保持單核細胞的活性，應避免冷凍和冷藏。
D. 稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養液，其成分會導致血細胞凝集，大大降低細胞得率及純度。
E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導致細胞掛壁，影響分離效果。
F. 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會影響分離效果，可以調節離心轉數和離心時間，摸索分離條件。
G. 吸取過多的單核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加；吸取過多的血漿層可能會導致單核細胞中血漿蛋白及血小板污染。
H. 如果要進一步對分離的細胞進行培養，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。
I. 不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散系數及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。 參考文獻
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 參考文獻：
《Responses of Transgenic Melatonin-Enriched Goats on LPS Stimulation and the Proteogenomic Profiles of Their PBMCs》 作者:Minghui Yang , Jingli Tao , Hao Wu , Lu Zhang, Yujun Yao , Lixi Liu , Tianqi Zhu , Hao Fan , Xudai Cui , Haoran Dou  and Guoshi Liu 期刊:International Journal of Molecular Sciences 影響因子:4.183 PMID:30111707