β-木糖苷酶活性檢測試劑盒 微量法

β-木糖苷酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2625
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支加入0.555 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑建議-20℃分裝保存2周，避免反復凍融（1支粉劑溶解后可做48S，為了延長使用時間，此產品多給1支粉劑）；

2. 標準品：5μmol/mL對硝基 苯*溶液。

產品說明：
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關鍵酶，產物木糖可作為碳源應用于微生物發酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應用于造紙工業，比傳統的漂白法環保，具有廣泛的應用價值。
β-木糖苷酶催化對硝基 苯*-β-D-木糖苷產生對硝基 苯*，對硝基 苯*在405nm處有特征吸收峰，測定405nm光吸收增加速率，可計算β-木糖苷酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、水浴鍋、蒸餾水、超聲破碎儀。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

• 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、植物樣本：稱取約0.1g樣本，加1mL提取液充分冰浴勻漿，然后12000rpm，4℃，離心20min，棄沉淀，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清作為待測酶液。

1. 細菌、真菌樣本：收集約500萬個細胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，棄沉淀 ，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計/酶標儀預熱30min 以上，調節波長至405nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2. 標準液的稀釋：用試劑二將標準液稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL，稀釋可參考下表。

備注：實驗中每個標準管需40µL標準溶液。

1. 樣本測定：

三、β-木糖苷酶活性計算
根據標準管的濃度（y，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（x，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（x，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（y，μmol/mL）。
1、按樣本蛋白濃度計算：
酶活定義：45℃，pH7.4時，每毫克蛋白質1min內催化產生1μmol對硝基 苯 *的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性（U/mg prot）=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)÷T=0.05×y÷Cpr
2、按樣本質量計算：
酶活定義：45℃，pH7.4時，每克樣本1min內催化產生1μmol對硝基 苯 *的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性（U/g 質量）＝(y×V樣)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.05×y ÷W
3. 按細胞數量計算：
酶活定義：45℃，pH7.4時，每10⁴個細胞1min內催化產生1μmol對硝基 苯 *的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性（U/10⁴ cell）= (y×V樣)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.0001×y
Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； V樣：加入反應體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬；T：反應時間，20min。

注意事項：

1. 吸光度變化應該控制在0.05~0.6之間。否則加大樣本量或稀釋樣本，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數要相應改變。

2. 樣本蛋白質含量需要另外測定。

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