山*醇脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法

山*醇脫氫酶（SDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2535
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：取3.4 mL試劑五加入1瓶試劑一粉劑中溶解，再加入一支試劑四，現用現配，24 h變質；

2. 標準品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即10 μmol/mL NADH標準品。-20℃保存4周，避免反復凍融。

產品說明：
SDH（EC 1.1.1.14）催化山*醇脫氫生成果糖，是調控生物體內山*醇含量的關健酶之一。SDH催化山*醇脫氫生成果糖，同時還原NAD⁺生成NADH，生成的NADH能將電子傳遞給NBT生成紫色的甲臜，根據這一原理可以計算SDH活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、超聲破碎儀，可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1 g組織，加入1 mL提取液），進行冰浴勻漿。8000 ×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟
1、可見分光光度計/酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長至570 nm，可見分光光度計蒸餾水調零。
2、標準管的測定：將10 μmol/mL NADH標準品用水稀釋至1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL的標準溶液
(1) 標準品稀釋表

實驗中每個標準管需20µL標準溶液。
（2）標準品測定表

3、樣本的測定：

將上述試劑按順序加微量玻璃比色皿/96孔板中，加試劑一的同時開始計時，記錄 10 秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準確反應3分鐘；迅速取出比色皿并擦干，570 nm下比色，記錄3分10秒時的吸光度A2，計算ΔA測定=A2-A1。（整個實驗過程要避光）

注意事項：
1.ΔA大于0.7時，建議將樣本用提取液稀釋后測量，計算公式中乘以稀釋倍數。
2.測定過程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活。
3.比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
參考文獻：
Aguayo M F, Ampuero D, Mandujano P, et al. Sorbitol dehydrogenase is a cytosolic protein required for sorbitol metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. Plant science, 2013, 205: 63-75.
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