酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)活性檢測(cè)試劑盒 微量法

酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC2355
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻。

2. 試劑二：臨用前取一支試劑二加1 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑2-8℃可以保存2周。(為了延長使用時(shí)間，因此多給一支試劑二)

產(chǎn)品說明：
AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種酰基化和去酰基化反應(yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用。
AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙酰基到丁醇，同時(shí)還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測(cè)定412 nm吸光度增加速率，來計(jì)算AAT活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。4℃，15000 g離心20min，取上清液待測(cè)。
2、血清（漿）樣本：直接檢測(cè)。（若液體有渾濁則離心后進(jìn)行測(cè)定）
二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在37℃水浴保溫20 min以上。

3. 樣本測(cè)定：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿/96孔板中，加試劑四的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在412nm波長下記錄10s時(shí)的初始吸光度A1和130s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA空=A2空-A1空；ΔA測(cè)=A2測(cè)-A1測(cè)，ΔA=ΔA測(cè)-ΔA空。空白管只需做1-2次。

注意事項(xiàng)：

1. 上清液蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

2. 當(dāng)吸光值大于1時(shí)，建議稀釋后測(cè)量。

3. 建議一個(gè)一個(gè)樣本測(cè)定，一人比色一人計(jì)時(shí)。

4. 如果ΔA測(cè)小于0.01，可以延長反應(yīng)時(shí)間，如測(cè)定10 s和310 s的吸光度，相應(yīng)修改計(jì)算公式中反應(yīng)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g腎臟加入1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后稀釋4倍后按測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA測(cè)=A2測(cè)-A1測(cè)=0.69-0.4929=0.1971、ΔA=ΔA測(cè)-ΔA空=0.1971-0.0049 =0.1922，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：AAT (U/g 質(zhì)量) =5000×ΔA÷W×4（稀釋倍數(shù)）=38440 U/g 質(zhì)量。

2. 取兔血清直接按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA測(cè)=A2測(cè)-A1測(cè)=0.629-0.5342 =0.0948、ΔA=ΔA測(cè)-ΔA空=0.0948-0.0049=0.0899，按血清體積計(jì)算酶活得：AAT (U/mL 血清) =5000×ΔA=5000×0.0899=449.5 U/mL 血清。

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