酰基轉移酶(AAT)活性檢測試劑盒 微量法

?；D移酶（AAT）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2355
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：內含不溶物，使用前搖勻。

2. 試劑二：臨用前取一支試劑二加1 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑2-8℃可以保存2周。(為了延長使用時間，因此多給一支試劑二)

產品說明：
AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內各種酰基化和去?；磻诨虮磉_、代謝和信號傳導中具有重要作用。
AAT催化乙酰CoA轉移乙?；蕉〈?，同時還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412 nm吸光度增加速率，來計算AAT活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織樣本：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。4℃，15000 g離心20min，取上清液待測。
2、血清（漿）樣本：直接檢測。（若液體有渾濁則離心后進行測定）
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min 以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。

2. 試劑一在37℃水浴保溫20 min以上。

3. 樣本測定：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿/96孔板中，加試劑四的同時開始計時，在412nm波長下記錄10s時的初始吸光度A1和130s后的吸光值A2，計算ΔA空=A2空-A1空；ΔA測=A2測-A1測，ΔA=ΔA測-ΔA空。空白管只需做1-2次。

注意事項：

1. 上清液蛋白質含量需要另外測定。

2. 當吸光值大于1時，建議稀釋后測量。

3. 建議一個一個樣本測定，一人比色一人計時。

4. 如果ΔA測小于0.01，可以延長反應時間，如測定10 s和310 s的吸光度，相應修改計算公式中反應時間。

實驗實例：

1. 取0.1g腎臟加入1mL提取液進行樣本處理，取上清后稀釋4倍后按測定步驟操作，用微量石英比色皿測得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA測=A2測-A1測=0.69-0.4929=0.1971、ΔA=ΔA測-ΔA空=0.1971-0.0049 =0.1922，按樣本質量計算酶活得：AAT (U/g 質量) =5000×ΔA÷W×4（稀釋倍數）=38440 U/g 質量。

2. 取兔血清直接按照測定步驟操作，測得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA測=A2測-A1測=0.629-0.5342 =0.0948、ΔA=ΔA測-ΔA空=0.0948-0.0049=0.0899，按血清體積計算酶活得：AAT (U/mL 血清) =5000×ΔA=5000×0.0899=449.5 U/mL 血清。

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