NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒 微量法

NADH氧化酶
（NOX）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC0635
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
試劑六：臨用前加入4.5 mL雙蒸水，用不完的試劑-20℃分裝保存。
產品說明：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD⁺。該酶不僅參與NAD⁺的再生，而且與免疫反應密切相關。
NOX能夠將NADH氧化為NAD⁺，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：
1、粗酶液的提取必須在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶變性失活。
2、比色皿中反應液的溫度最好保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、實驗時，試劑六樣本在冰上放置，以免變性和失活。
5、因通過反應速率計算酶活，使用96孔板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數量。
6、推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
7、附：使用樣本質量計算公式
A、按微量玻璃比色皿計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX上清活性（U/g 質量）=ΔA1÷0.01×V反總÷(W÷V提取×V樣)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 質量）=ΔA2÷0.01×V反總÷(W÷V樣總×V樣)÷T=505×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 質量）= NOX上清+ NOX沉淀=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W
ΔA1：上清測定值；ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入試劑一體積，1.01mL；V樣總：沉淀重懸體積，0.202mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1min。
B、按96孔UV板計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。
NOX上清活性（U/g 質量）=ΔA1÷0.005×V反總÷(W÷V提取×V樣)÷T=5050×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 質量）=ΔA2÷0.005×V反總÷(W÷V樣總×V樣)÷T=1010×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 質量）= NOX上清+ NOX沉淀=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W
ΔA1：上清測定值；ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入提取液體積，1.01mL；V樣總：沉淀重懸體積，0.202mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1min。
實驗實例：

1. 取0.1g肺進行樣本處理，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得ΔA1=ΔA測定-ΔA對照=（0.8136-0.118）-（0.9216-0.8079）=0.5819，ΔA2=ΔA測定-ΔA對照=（0.8546-0.4736）-（0.9539-0.9121）=0.3392，按樣本質量計算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.5819÷0.1=14692.975
NOX沉淀活性（U/g 質量）=505×ΔA2÷W=505×0.3392÷0.1=1712.96
NOX活性（U/g 質量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.5819÷0.1+505×0.3392÷0.1=16405.935 U/g 質量。

1. 取0.1g葉片進行樣本處理，按照測定步驟操作，用微量玻璃比色皿測得ΔA1=ΔA測定-ΔA對照=（0.8518-0.7998）-（0.886-0.8831）=0.0491，ΔA2=ΔA測定-ΔA對照=（0.872-0.8296）-（0.916-0.9149）=0.0413，按樣本質量計算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.0491÷0.1=1239.775
NOX沉淀活性（U/g 質量）=505×ΔA2÷W=505×0.0413÷0.1=208.565
NOX活性（U/g 質量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.0491÷0.1+505×0.0413÷0.1=1448.34 U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Dou S, Liu S, Xu X, et al. Octanal inhibits spore germination of Penicillium digitatum involving membrane peroxidation[J]. Protoplasma, 2017, 254(4): 1539-1545.

2. Liu P, Zhang H M, Hu K, et al. Sensory plasticity of carotid body is correlated with oxidative stress in paraventricular nucleus during chronic intermittent hypoxia[J]. Journal of cellular physiology, 2019, 234(8): 13534-13543.

3. Yongtao Du,Mengjie Zhao,Changtao Wang,et al. Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress. BMC Plant Biology. December 2018;(IF3.67)

1. Youqiang Xu,Chunyan Xu,Xiuting Li,et al. A combinational optimization method for efficient synthesis of tetrame thylpyrazine by the recombinant Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal. January 2018;(IF3.371)

2. Weida Li,Kai Wang,Nanfang Jiang,et al. Antioxidant and antihyperlipidemic activities of purified polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Applied Phycology. April 2018;(IF4.784)

參考文獻：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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