NADP-蘋果酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法

NADP-蘋
果酸脫氫酶（NADP-MDH）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
貨號(hào)：BC1055
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入500 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑三：臨用前加入600 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產(chǎn)品說明：
MDH（EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物，連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD^-依賴的MDH和NADP^-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。
NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 樣本的提取必須在0℃-4℃中操做完成，以防止酶變性失活。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃放置。

3. 建議一人加樣一人比色。因時(shí)間監(jiān)測(cè)范圍小，不推薦用96孔UV板同時(shí)測(cè)多個(gè)樣本。

4. 用分光光度計(jì)時(shí)，當(dāng)初始值小于0.7或者ΔA大于0.5時(shí)，建議稀釋后測(cè)量。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g心臟組織加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=0.7173-0.6399=0.0774，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.0753，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NADP-MDH（U/g 質(zhì)量）=6430×ΔA÷W=6430×0.0753 ÷0.1=4841.79 U/g 質(zhì)量。

1. 取5μL血清直接按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定= 0.6934-0.6854=0.008，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.0059，按血清/血漿體積計(jì)算酶活得：

NADP-MDH（U/mL）=6430×ΔA=6430×0.0059=37.937 U/mL。
參考文獻(xiàn)：

1. Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.

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