總果膠含量檢測試劑盒

肌酸激酶（CK）活性檢測試劑盒說明書 

微量法

貨號：BC1145

規格：100T/96S 

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加5 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

2、 試劑二：臨用前加入0.5 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

3、 試劑三：臨用前加入0.5 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

4、 試劑四： 臨用前加入0.65 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

5、 工作液：臨用前根據用量將試劑一、試劑二、試劑三、試劑四、試劑五以70:4:7:10:90的比例混合（體積比）?，F用現配。使用前室溫孵育20min（該步驟不可省略）。

產品說明： 

肌酸激酶（Creatine Kinase，CK） (EC 2.7.3.2)也成為肌酸磷酸激酶，主要存在于心臟、肌肉以及腦等組織中，能可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應，是一個與細胞能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶。

 CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP與葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖與NADP⁺生成NADPH，導致340nm光吸收值增加，以此來表示CK酶活。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔UV板、恒溫水浴鍋、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2. 血清樣本：直接測定。

3. 細胞樣本：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）加入提取液，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g離心10min，取上清待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，用蒸餾水調零。

2、 操作表：在微量石英比色皿/96孔板中加入下列試劑

三、CK 活性計算

1、按微量石英比色皿計算

(1) 按組織蛋白濃度計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時，每毫克蛋白質每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。

CK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr

(2) 按組織樣本質量計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時，每克樣本每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。

CK活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=268×ΔA÷W

(3) 按血清體積計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時，每mL血清每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。

CK活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=268×ΔA

(4) 按細胞數量計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時，每1萬個細胞每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。

CK活性（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數量)÷T=268×ΔA÷細胞數量

ε：NADPH的摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；細胞數量：以10⁴為單位計算，萬個；T：反應時間，3min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。

2、按96孔UV板計算

將上述公式中的d=1cm改為0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

1. 血清的CK不穩定，采集樣本后盡快測定，4℃避光保存可穩定24h。

2. 樣本蛋白質含量需要另外測定。

3. OD 值大于0.6可用提取液適當稀釋樣本，并在計算公式中相應的改變稀釋倍數。

4. ΔA空白管一般不超過0.01。

實驗實例：

1、 取0.1g小鼠腦加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后再用提取液稀釋8倍，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.4175-0.1314=0.2861，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.2861-0.0048=0.2813，按組織樣本質量計算得：

CK活性（U/g 質量）=268×ΔA÷W×8（稀釋倍數）=268×0.2813÷0.1×8（稀釋倍數）=6031.072 U/g 質量。

2、 取兔血清直接檢測，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.5761-0.4649=0.1112，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1112-0.0048=0.1064，按血清體積計算得：CK活性（U/mL）=268×ΔA=268×0.1064=28.5152 U/mL。

相關發表文獻：

[1] Defang Li, Ning Lu, Jichun Han,et al. Eriodictyol Attenuates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through the Activation of JAK2. Frontiers in Immunology. January 2018;(IF3.845)

[2] Xu Y, Meng X, Hou X, et al. A mutant of the Buthus martensii Karsch antitumor-analgesic peptide exhibits reduced  inhibition to hNav1. 4 and hNav1. 5 channels while retaining analgesic activity[J].Journal of Biological Chemistry, 2017,  292(44): 18270-18280

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