丙酮酸羧化酶（PC）檢測(cè)試劑盒 糖異生系列

丙tong酸羧化酶（PC）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào): BC0730
規(guī)格: 50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑四：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑六：臨用前加入0.2mL試劑六稀釋液溶解，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑六工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.05mL：1.5mL（共1.55mL，約15T）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完；

5. 工作液的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四=2:1:1的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：“具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件"

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，ΔA大于0.8時(shí)，建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）來(lái)測(cè)定。

2. 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過(guò)0.05。

3. 樣本的蛋白濃度需自行測(cè)定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約1mg/mL），所以測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

5. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應(yīng)。

6、附:使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S）
A、上清中PC活力的計(jì)算:
酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC酶活（U/g質(zhì)量）=ΔA1÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：2min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中PC活力的計(jì)算:
酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC酶活（U/g質(zhì)量）=ΔA2÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA2÷W
ΔA2：上清測(cè)定值；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V提取：沉淀重懸體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：2min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
C、樣本PC總活力的計(jì)算:
樣本PC總活力即為上清中PC活力與沉淀中PC活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：PC（U/g 質(zhì)量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔心組織加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，用提取液稀釋上清100倍，稀釋沉淀4倍，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算上清中ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.104-0.856=0.248，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.021-0.988=0.033，ΔA1=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.248-0.033=0.215，沉淀中的ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.07-0.716=0.354，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.021-0.988=0.033，ΔA2=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.354-0.033=0.321；按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

上清：PC的酶活（U/g 質(zhì)量）=1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))=1607×0.215÷0.1×100=345505 U/g 質(zhì)量
沉淀：PC酶活U/g 質(zhì)量)=1607×ΔA2÷W×4(稀釋倍數(shù))=1607×0.321÷0.1×4=20633.88 U/g 質(zhì)量
樣本PC總酶活（U/g 質(zhì)量）=1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數(shù))+1607×ΔA2÷W
=1607×0.215÷0.1×100+1607×0.321÷0.1×4=366138.88 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

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