焦磷酸化酶（UGP）檢測(cè)試劑盒 糖原

UDPG焦磷酸化酶（UGP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。

貨號(hào)：BC3360

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加30mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃可保存4周，禁止反復(fù)凍融。

2. 試劑二：臨用前取1瓶加2.5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑2-8℃保存2周。

3. 試劑三：臨用前取1支加0.7 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃可保存4周，禁止反復(fù)凍融。

4. 試劑四：臨用前取1支加1 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃可保存2周，禁止反復(fù)凍融。

5. 工作液的配制：將試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六按體積比=600：100：20：40：100：250混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP，EC 2.7.7.9）在自然界廣泛分布。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG），UDPG是高等植物和動(dòng)物中主要活化酶的形式，作為葡萄糖基供體參與糖原、蔗糖、纖維素等的合成代謝。

UGP可逆的催化生成1-磷酸葡萄糖，其在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，UGP活性可以用340nm的吸光值的變化來(lái)反應(yīng)。  

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清等液體：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：

三、UGP酶活計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生1nmol 的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（U/g 質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（U/10⁴ cell）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA

4. 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（U/mL）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g ；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1. 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過(guò)0.01。

2. ΔA大于0.6或者A2測(cè)定大于1.2時(shí)，建議將樣本稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）來(lái)測(cè)定。

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