輔酶ⅠNAD（H）含量試劑盒

輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號: BC0310

規(guī)格: 50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：需要嚴格避光；

2、試劑六：72 mL乙醇和3 mL蒸餾水混合，備用；

3、NAD標準品：臨用前加入1.5 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NAD標準溶液備用；

4、NADH標準品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NADH標準溶液備用。

產(chǎn)品說明：

輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙酰*腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH（還原型輔酶I）。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學滲透偶聯(lián)的方式，合成ATP。NAD(H)在機體內(nèi)有重要的生理意義，與物質代謝、能量代謝、抗細胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關。體內(nèi)輔酶I含量降低會導致細胞損傷或衰亡。

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值， NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、NAD⁺和NADH的提取（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、血清（漿）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：取0.1mL血清（漿），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴冷卻后，10000g 4℃離心10min；取上清200µL，加入等體積堿性提取液；混勻，10000g 4℃離心10min，取上清，冰上保存待測。

NADH的提取：取0.1mL血清（漿），加入0.5mL堿性提取液，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴冷卻后，10000g 4℃離心10min，取上清200µL，加入等體積酸性提取液；混勻，10000g 4℃離心10min，取上清,冰上保存待測。

2、組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：稱取約0.1g組織，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴冷卻后，10000g 4℃離心10min，取上清200µL，加入等體積堿性提取液混勻，10000g 4℃離心10min，取上清，冰上保存待測。

NADH的提取：稱取約0.1g組織，加入0.5mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴冷卻后，10000g 4℃離心10min，取上清200µL，加入等體積酸性提取液混勻，10000g 4℃離心10min，取上清，冰上保存待測。

3、細胞或細菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：收集500萬細胞或細菌，加入0.5mL酸性提取液，超聲波破碎1min（功率200W，超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min，取上清液200μL至另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃離心10min，取上清，冰上保存待測。

   NADH的提取：收集500萬細胞或細菌，加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎1min（功率200W，超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min，取上清液200μL至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃離心10min，取上清，冰上保存待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預熱30分鐘以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）

混勻， 570nm下比色，讀取吸光值ΔA測定=A測定管-A對照管，NAD標準管的記為ΔA標準1=A標準管1-A空白管。NADH標準管的記為ΔA標準2=A標準管2-A空白管。（空白管只需做1-2次）

三、NAD⁺含量的計算

1、血清（漿）中NAD⁺含量計算

NAD⁺（nmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標準1÷C標）×V提取÷V血清=12.5×ΔA測定÷ΔA標準1

2、組織、細菌、細胞中NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ （nmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標準1÷C標）×V提取÷(V提取×Cpr)= 1.25×ΔA測定÷ΔA標準1 ÷ Cpr

(2)按樣本質量計算

NAD⁺（nmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準1÷C標）×V提取÷W= 1.25×ΔA測定÷ΔA標準1÷W

(3)按細菌或細胞數(shù)量計算

NAD⁺（nmol/10⁴ cell）=ΔA測定÷（ΔA標準1÷C標）×V提取÷500=0.0025×ΔA測定÷ΔA標準1

四、NADH含量的計算

1、 血清（漿）中NADH含量計算

NADH（nmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標準2÷C標）×V提取÷V血清=12.5×ΔA測定÷ΔA標準2

2、組織中NADH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH（nmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標準2÷C標）×V提取÷(V樣品×Cpr)=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷ Cpr

(2)按樣本質量計算

NADH（nmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準2÷C標）×V提取÷W=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷W

(3)按細菌或細胞數(shù)量計算

NADH（nmol/10⁴ cell）=ΔA測定÷（ΔA標準2÷C標）×V提取÷500=0.0025×ΔA測定÷ΔA標準2

C標：NAD或NADH標準溶液的濃度，1.25nmol/mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V提取：加入提取液總體積，1mL；V血清：提取時加入的血清體積，0.1mL；W：樣本質量，g；500：500萬個細胞。

注意事項：

1、操作過程應避光。不可將試劑一、二、三混合后再加，必須分開加。

2、反應過程要注意避光。

3、當吸光值大于1時，建議稀釋后測量，計算公式中應當乘以稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1、 NAD⁺的提取：稱取約0.1g肺，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.341-0.321=0.02，ΔA標準1=A標準1-A空白=1.045-0.246=0.799，按樣本質量計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準1÷W=1.25×0.02÷0.799÷0.1=0.3129 nmol/g 質量。

NADH的提取：稱取約0.1g肺，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.2-0.136=0.064，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.687-0.252=0.435，按樣本質量計算NADH 含量得：NADH(nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷W=1.25×0.064÷0.435÷0.1=1.839 nmol/g 質量。

2、 NAD⁺的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定- A對照=0.259-0.129=0.13，ΔA標準1=A標準1-A空白=1.045-0.246=0.799，按樣本質量計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）= 1.25×ΔA測定÷ΔA標準1÷W=1.25×0.13÷0.799÷0.1=2.03379 nmol/g 質量。

NADH的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.194-0.086=0.108，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.687-0.252=0.435，按樣本質量計算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷W=1.25×0.108÷0.435÷0.1=3.1034 nmol/g 質量。

3、 NAD⁺的提取：稱取約0.1mL馬血清，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.091-0.061=0.03，ΔA標準1=A標準1-A空白=1.045-0.246=0.799，按液體體積計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測定÷ΔA標準1=12.5×0.03÷0.799=0.4693 nmol/mL。

NADH的提取：稱取約0.1mL馬血清，按照提取和測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.126-0.1=0.026，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.687-0.252=0.435，按液體體積計算NADH 含量得：NADH含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測定÷ΔA標準2=12.5×0.026÷0.435=0.7471 nmol/mL。

相關發(fā)表文獻：

[1] Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)

[2] Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicaine. 2018;(IF1.984)

[3] Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)

[4] Yang K, Yin Q, Mao Q, et al. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.

參考文獻：

[1] Ying W. NAD⁺/NADH and NADP⁺/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences[J]. Antioxidants & redox signaling, 2008, 10(2): 179-206.

[2] Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.

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