線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性測試盒 微量法

線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ/ATP合酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1445
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前每支加入1.11 mL雙蒸水，充分溶解備用，分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

2. 試劑五：臨用前加入10mL雙蒸水，充分溶解；-20℃可保存4周；

3. 試劑六：臨用前加入10mL雙蒸水，充分溶解；2-8℃可保存4周；

4. 標準品：10 μmol/mL磷標液，臨用前取50μL 10 μmol/mL磷標液，加入1950μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.25μmol/mL標準液使用，現用現配（實驗中每管需要40μL，為減小實驗誤差，故配制大體積）；

5. 定磷試劑的配制：根據用量將H₂O：試劑五：試劑六：試劑七=20mL:10mL:10mL:10mL（約100T）混合備用，配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
產品說明：
線粒體復合體Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中，由F₁和F₀兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。
復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。
   
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數。

2. 測定胞漿時，定磷后反應液可能會有絮凝產生，測定前混合均勻即可，并不影響測定結果。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

4. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應。

5. 附:使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數為100T/24S）

1. 上清中復合體Ⅴ活力的計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=ΔA1÷ΔA標準×C標準×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=20×ΔA1÷ΔA標準÷W
ΔA1：上清測定值；C標準：標準溶液濃度，0.25μmol/mL；1000：單位換算系數，1μmol=1000nmol；V提取：加入提取液體積，1.0mL；V樣本：樣本體積，0.05mL；V酶促：酶促反應總體積，0.12mL；T：反應時間，30min。
B、沉淀中復合體Ⅴ活力的計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=ΔA2÷ΔA標準×C標準×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=12×ΔA2÷ΔA標準÷W
ΔA2：沉淀測定值；C標準：標準溶液濃度，0.25μmol/mL；1000：單位換算系數，1μmol=1000nmol；V提取：沉淀重懸體積，0.6mL；V樣本：樣本體積，0.05mL；V酶促：酶促反應總體積，0.12mL；T：反應時間，30min。
C、樣本復合體Ⅴ總活力的計算：
樣本復合體Ⅴ總活力即為上清中復合體Ⅴ活力與沉淀中復合體Ⅴ活力之和。
按樣本質量計算：復合體Ⅴ（U/g 質量）=20×ΔA1÷ΔA標準÷W+12×ΔA2÷ΔA標準÷W
實驗實例：

1. 取0.1g兔子腎臟進行樣本處理，上清液和沉淀都稀釋4倍后按照測定步驟操作，使用96孔板測得ΔA標準=A標準管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1=A測定管-A對照管=0.679-0.119=0.560，沉淀的ΔA2=A測定管-A對照管=0.773-0.052=0.721，則按樣本質量計算得：上清中復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=20×ΔA1÷ΔA標準÷W×4（稀釋倍數）=1349.4 U/g 質量沉淀中復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=12×ΔA2÷ΔA標準÷W×4（稀釋倍數）=1042.4 U/g 質量復合體Ⅴ（U/g 質量）=20×ΔA1÷ΔA標準÷W×4+12×ΔA2÷ΔA標準÷W×4=2391.8 U/g 質量。

2. 取0.1g冬青進行樣本處理，上清液和沉淀都稀釋2倍后按照測定步驟操作，使用96孔板測得ΔA標準=A標準管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1= A測定管-A對照管=0.535-0.320=0.215，沉淀的ΔA2=A測定管-A對照管=0.357-0.089=0.268，則按樣本質量計算得：上清中復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=20×ΔA1÷ΔA標準÷W×2（稀釋倍數）=259.04 U/g 質量 沉淀中復合體Ⅴ活性（U/g 質量）=12×ΔA2÷ΔA標準÷W×2（稀釋倍數）=193.73 U/g 質量復合體Ⅴ（U/g 質量）=20×ΔA1÷ΔA標準÷W×2+12×ΔA2÷ΔA標準÷W×2=452.77 U/g 質量。

相關發表文獻：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)  

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J].Free Radical Biology and Medicine,2019,134:229-238.

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