western blot的作用

western blot的作用

免疫印跡是一個用于蛋白質分析的常規技術，在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉移一種固相支持物，然后利用抗原—抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性地確定正常或實驗條件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。Western blot還可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后續分析，作為一種廉價、便捷、可靠的研究工具，將與質譜和蛋白質芯片等技術一起在蛋白質組時代發揮重要作用。

Western bloting的注意事項

1、為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設計對照實驗，對照分為：陽性對照（好有標準品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關對照（用無關抗體）

2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景

3、實驗設計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。

4、凝膠的質量直接影響以后的實驗結果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。

5、電泳、轉膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產生氣泡；盡量讓電轉溫度保持在10度以下，冰浴為宜。

6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；