western blot的原理及應用

Westernblot法即是一種將電泳與KIJSA結合起來的技術，可分為電泳、轉印、酶免疫測定3個階段。Westernblot法結合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學測定方法。

western blot的作用

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

Westernblot的應用

Westernblot法應用分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中時常會用到的一種實驗方法，并且是一種能對蛋白進行定性和半定量的分析方法。是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。

蛋白質分析中應用的W estern雜交法與DNA分析應用的Southern雜交法相似，均是把電流分離的組分從凝膠轉移一種固相支持體，并均以針對特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern雜交法)序列所制備的特異性樣品作為探針檢測其相同或相似序列。

對于蛋白質來說，通常使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。Westernblot法的主要優點在于，它能夠從生物組織的粗提物或部分純化的粗提物中檢測和識別幾種特異的蛋白質。將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離的蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠上通過電轉移到一張合適的印跡膜上，隨后用和靈敏檢測系統相偶聯的抗體來識別結合在膜上的一種或幾種蛋白質。這一技術的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而又無需像免疫沉淀法那樣必須對靶蛋白進行放射性標記。因此要對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特定蛋白進行鑒別和定量時，Westernblot法極為有用。此外，由于蛋白質的電泳分離幾乎總在變性條件下進行，因此溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題全都無需加以考慮。