培養(yǎng)基的配制與滅菌方法說明

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有水、氮源、無機鹽（包括微量元素）、碳源、生長因子（維生素、氨基酸、堿基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
      不同培養(yǎng)基可根據(jù)實際需要，添加一些自身無法合成的化合物，即生長因子。有些微生物，如自養(yǎng)型微生物，不需要碳源，所以上述物質只具有一般性。培養(yǎng)基由于配制的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養(yǎng)基在受熱、吸潮后，易被細菌污染或分解變質，因此一般培養(yǎng)基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養(yǎng)基（如組織培養(yǎng)基），較長時間的貯存，必須放在3-6℃的冰箱內。由于液體培養(yǎng)基不易長期保管，均改制成粉末。
培養(yǎng)基的配制
1.配料
      配方換算→在容器中加入少量水（蒸餾水，自然水）→按照配方稱取各種藥品（依次加入）→加足所需水量（一藥一勺，取藥后立即蓋上瓶蓋）。
2.溶解
      淀粉溶解：少量冷水調成糊狀加熱溶解，特別是加有瓊脂的培養(yǎng)基，一定要煮沸，瓊脂的熔解溫度95-97℃ ，且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。
3.調PH
       用1N的鹽酸或1N的 NaOH把培養(yǎng)基調節(jié)到所要求的值。
4.過濾
       濾紙或棉花進行過濾。（有時可以省去）
5.分裝
      一般培養(yǎng)基放在三角瓶或試管中滅菌使用。
(1)三角瓶
      若作靜置培養(yǎng)，則100ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，多不能超過150ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，否則滅菌時培養(yǎng)基沸騰容易污染棉塞，造成染菌；若作搖瓶培養(yǎng)，則15-20ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，保證通氣良好。
(2)試管分裝
      液體培養(yǎng)基一般裝4-5ml，約試管的1/4高度；固體斜面培養(yǎng)基一般裝3-4ml，約試管的1/5高度。
6.包扎
      分裝好后，塞上棉塞，在用牛皮紙將棉塞包裹好，防止滅菌時水份進入把棉塞弄濕。
7.滅菌
      按配方上要求的溫度、壓力進行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高，營養(yǎng)成分會被破壞，培養(yǎng)基中的糖、氨基酸會使培養(yǎng)基的顏色變深。
8.擺斜面
      滅菌后需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放，使其凝固成為一個斜面，約占試管長度的1/2。
9.貯存
      培養(yǎng)基在30℃下放置，無污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放于2-8℃冰箱中備用。
培養(yǎng)基的滅菌
      滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
      加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內 蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
      濕熱滅菌有煮沸消毒法和高壓蒸汽滅菌法兩種，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進煮沸消毒器內加水煮沸。對于細菌的營養(yǎng)體煮沸約15～30min，對于芽孢則需煮沸約1～2h。
      高壓蒸汽滅菌法是高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。
培養(yǎng)基注意事項
      1、確認工作細胞庫是否被污染，確認毒種工作種子批是否被污染，確認所用培養(yǎng)基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認并排除。同時要對無菌試驗培養(yǎng)基的靈敏度進行驗證。實際生產中，可以從配制好的培養(yǎng)液中取少量加入營養(yǎng)瓊脂于恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，48小時即可觀察有無污染。
     2、其它：高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證，確保滅菌和除菌效果;前者應在投產前及其后的每6個月進行驗證，后者應在每次除菌前、后進行驗證工作(少應在除菌后進行一次)。
     3、另外，應將有毒區(qū)與無毒區(qū)嚴格分開，并有各自獨立的空氣凈化系統(tǒng)及孵室，有毒區(qū)對無毒區(qū)應保持相對負壓，防止病毒對培養(yǎng)細胞(尤其是細胞庫)的污染。