簡述實驗室微生物培養步驟方法

微生物培養（microculture)是生物培養的中的一種。所培養的微生物主要有病毒、細菌、放線菌、真菌等。微生物培養需要用到培養基，根據微生物的不同種類和生活習性來配制特定的培養基。微生物培養成功的關鍵在于無菌操作，如果培養器具和培養基不能*滅菌、培養的過程中有雜菌污染是很容易失敗的。那么微生物培養步驟有哪些呢？

實驗室微生物培養步驟

實驗材料

1 培養基和菌種

淀粉瓊脂培養基(高氏I號培養基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，查氏瓊脂培養基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營養肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

2 溶液或試劑

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3 儀器或其它用具

無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環，無菌培養皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細胞計數板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

微生物培養步驟

1、流程

倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養→挑單菌落→保存。

2、步驟

2.1稀釋涂布平板法

2.1.1 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、高氏I號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基加熱溶化待冷55～60℃時，高氏I號瓊脂培養基中加入10%酚數滴，馬丁氏培養中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支試管。

2.1.3 涂布

將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應平板培養基表面中央位置。用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養基。

2.1.4 培養

將高氏I號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置于28℃溫室中培養3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養2～3d。

2.1.5 觀察并挑菌落

將培養后長出的單個菌落根據其大小、顏色、形狀等特征進行觀察，之后根據菌落不同特征分別挑取少許細胞接種到上述三種培養基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養。若發現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

2.2 平板劃線分離法

2.2.1 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養基名稱、土樣編號和實驗日期。

2.2.2 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。

用接種環以無菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環，先在平板培養基的一邊作*次平行劃線3～4條，再轉動培養皿約70度角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過*次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養皿蓋，倒置于溫室培養。