聚丙烯酰胺凝膠電泳原理以及注意事項(xiàng)

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide?gel?electrophoresis）聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。

聚丙烯酰胺凝膠電泳作用：

用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合。化學(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對聚合作用是重要的，因?yàn)檫^低pH沒有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過多的氧分子存在，會使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時(shí)，在加過硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)，產(chǎn)生自由基使Acr發(fā)生聚合作用。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是：C = 6.5－0.3T此式可用于計(jì)算T為5％～20％時(shí)的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1％，當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大，C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中常用的C是2.6％和3％。

聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)：

1、可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。( x%

2、能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。

3、由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2，沒有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會產(chǎn)生“電滲”。

4、由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。

5、透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。

6、無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。

7、還可以用作固定化酶的惰性載體。

聚丙烯酰胺膠電泳體系有二種：連續(xù)體系與不連續(xù)體系。前者指整個(gè)電泳體系中所用的緩沖液成分、PH、凝膠網(wǎng)都相同；后者指在電泳體系中采用兩種以上的緩沖液、PH值和孔徑。按電泳裝置不同又可分為垂直管狀(圓盤)電泳和垂直平板電泳。這兩種電泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝膠的支架或?yàn)椴ＡЧ埽驗(yàn)椴ＡО?。這里以常用的不連續(xù)體系的管型盤狀電泳為例，說明凝膠分離蛋白質(zhì)的機(jī)理。