嘌呤霉素篩選細胞的原理

嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一種蛋白質合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結構，能夠同氨基酸結合，代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點結合，并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細胞方法如下：
嘌呤霉素篩選細胞
轉染（24孔板進行）或電轉后培養24小時，按10%密度傳代（傳36mm平皿），繼續培養24小時，待細胞密度增20%-25%回合時；
去掉培養液，PBS洗一次，加入按照佳嘌呤霉素篩選細胞的濃度（殺傷曲線試驗確定）配制好的嘌呤霉素篩選細胞培養基2-3ml。
根據培養基的顏色和細胞的存活情況，每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細胞用培養基（培養基用量為2-4ml，細胞多，多家培養基，細胞少，少加培養基），一般在3-1天內出現細胞大量或少量死亡情況（如果轉染效率或電轉效率高，則死亡少；如果轉染率或電轉率低，則死亡多；如果篩選濃度偏低，嘌呤霉素篩選細胞培養基用量少，細胞密度大于80%，會導致大量假陽性克隆）。如果少選*周，出現細胞大量死亡，則在原培養皿中繼續加入嘌呤霉素篩選細胞培養基篩選一周；如果刪選*周，出現細胞少量死亡，則把細胞按照10%密度傳代（傳35mm平皿，傳一個皿即可，多余細胞丟棄），利用少選培養基進行篩選一周；
篩選第二周結束后，則把細胞消化下來。進行重點稀釋（10ul培養基中含1個細胞，用篩選培養基），把上述10ul細胞懸液假日96孔板中（提前加入40ul篩選培養基），伊紅加入24孔，4小時候觀察每個孔的情況。記錄只含一個細胞的孔，含有一個細胞的孔用于繼續篩選，其余孔舍棄；
根據培養基的顏色和細胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細胞用培養基待細胞密度為80%時，將其傳代24孔板中增殖，待細胞密度為80%時，將其傳代6孔板中增殖，待細胞密度為80%時，將其傳代T25瓶（一傳3）中增殖，每隔3天換液。
細胞大量擴增后，一瓶用于提取中RNA進行QPCR檢測，一瓶用于總蛋白進行WB檢測，另一瓶用于保種，根據QPCR和WB結果取舍陽性克隆。
嘌呤霉素篩選細胞方法如上，具體的嘌呤霉素篩選細胞讓發如上，嘌呤霉素穩定性高，可以常溫運輸，收到產品后4℃存放；
嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個月，4℃條件下保質期一年。為了達到理想的穩定狀態和長的保質期，好存放于-20°C，保質期為2年。