考馬斯亮藍測蛋白質方法

蛋白質濃度測定的方法有很多，考馬斯亮藍測定蛋白質是實驗室常見的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便，
考馬斯亮藍測蛋白質原理：
考馬斯亮藍G-250(Coomassie?brilliant?blue?G-250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。該染料在游離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白質濃度范圍內（1-1000μg），蛋白質與色素結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。

考馬斯亮藍G-250于蛋白質結合反應十分迅速，2min左右即達到平衡。其結合物在室溫下1h內保持穩定。此法靈敏度高，易于操作，干擾物質少，是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質與色素結合狀況有一定差異。

材料、儀器設備及試劑

1、材料

小麥葉片、馬鈴薯塊莖、或其他植物材料

2、儀器設備<

分光光度計、研缽、燒杯、移液管

3、試劑

（1）標準蛋白質溶液：100μg·Ml-1牛血清白蛋白：稱取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋100ml即可。

（2）考馬斯亮藍G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50ml90%乙醇中，加100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L，貯于棕色瓶中，常溫下可保存一個月。

考馬斯亮藍測蛋白質方法：

（1）標準曲線的繪制?取6支具塞試管，按表加入試劑。混合均勻后，向各管中加入5ml考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質

濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品測定

樣品提取：取鮮樣0.5g，加入2ml蒸餾水研磨，磨成勻漿后用6ml蒸餾水沖洗研缽，洗滌液收集在同一離心管中，在4000r/min下離心10min，棄去沉淀，上清液轉入容量瓶，以蒸餾水定容10ml，搖勻后待測

（2）吸取樣品提取液0.1ml，放入具塞試管中（每個樣品重復2次），加入5ml考馬斯亮藍<

G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得蛋白質含量。

（3）結果計算（單位mg/g）樣品中蛋白質含量=（C·VT）/(1000?VS·WF)

（參考文獻：郝建軍，康宗利，于洋，植物生理學實驗技術，北京：化學工業出版社，2006.12，107-109）

注意事項

在試劑加入后的5-20 min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是穩定的。

測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。

利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差