免疫沉淀的具體步驟說明

免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

溶液制備

緩沖液：

50毫米Tris-HCl pH 7.4；

氯化鈉150毫米；

1毫米EDTA；

1% Triton1% x 100；

Na脫氧膽酸；

0.1% SDS；

1毫米的PMSF；

1μ克/毫升抑肽酶；

1μ克/毫升亮肽素；

PBS，pH7.4：

10毫米1.8毫米的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉50毫米，2.7毫米氯化鉀

1X樣品緩沖液：

65 mM Tris-Cl，pH8.0，10%（v/v）甘油，2.3%（W/V）SDS，

0.01%溴酚藍，1% DTT。

協(xié)議

1、 與pbs-edta或胰蛋白酶收獲細胞，計數(shù)細胞。

2、裂解細胞在預(yù)冷的緩沖液（1毫升/ 107細胞）在4個小時的1小時搖動。

3、離心20 min 14000克在4°c.transfer超游泳的一個新的管。

4、通過洗滌兩次制備蛋白質(zhì)/克瓊脂糖珠PBS和恢復(fù)到50%液珠懸浮用緩沖液。

5、預(yù)先明確的細胞裂解液加入50毫升珠漿每毫升細胞裂解液孵育4°C搖擺10分鐘，1000分鐘，4分鐘，10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新管。

6、準(zhǔn)備IP反應(yīng)的移液0.5毫升預(yù)清除細胞裂解液（相當(dāng)于5×10 6細胞）進入一個新的管添加1-4毫克抗體反應(yīng)和孵化每搖擺在冰上3小時。佳的抗體量要求免疫沉淀的抗原的細胞是從一個給定的國家應(yīng)該實證檢驗。

7、添加50%毫升50泥漿珠和巖石為1小時，在4角。

8、離心樣品在10000克為15秒微量離心機。仔細地丟棄的上清液。

9、兩次洗珠與1毫升緩沖液（去除非特異性相關(guān)蛋白），然后3次用1 ml PBS去除洗滌劑。

10、后，懸珠在60毫升的樣品緩沖液，和在95°C下煮沸5分鐘，離心樣品10000克15秒的離心加載前對聚丙烯酰胺凝膠電泳。