蛋清溶菌酶操作步驟

(一)蛋清溶菌酶的分離提取

1.變性與等電點選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋，加20%HAc 調pH4.6，3000r/min 離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL(Ⅰ)待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內迅速升溫75℃，用流動水速冷后，3000r/min 離心20min，收集上清液，紀錄體積，并留樣2mL(Ⅱ)待分析。

2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當凝聚物出現后，靜置30min 使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進行離心或簡單過濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL(Ⅲ)待分析。

3.Sephadex G-50 柱層析

(1)裝柱：稱取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸餾水溶脹6小時以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。

(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl 使終濃度為50g/L，上樣時先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過10mL。加完后打開層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內。

(3)洗脫：樣品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動泵，繼續6g/LNaCl 洗脫，調節操作壓力使流速控制在7~8mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。

(4)分析：紀錄各管體積，紫外光吸收法測定各管中蛋白質濃度。合并含有蛋白質的收集管，草酸鑒定Ca2+ ，留樣(Ⅳ)待分析。

4.乙二醇濃縮：將洗脫液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加蓋容器中。當酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮5mL 左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣

0.5mL(Ⅴ)待分析。

(二)溶菌酶活力測定

取上述各待測酶液稀釋30~50倍，進行酶活測定。用微量進樣器取酶液樣品10μL，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5)，混合均勻，37℃預熱2min，然后加入同樣已預熱過的菌懸液0.5mL。37℃保溫反應15min 后，用2mL 乳化劑停止反應。
反應液經3000r/min 離心10min，取清液在721型分光光度計上進行比色(540nm)。空白管用磷酸緩沖液替代樣液。

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