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          體內(nèi)處理精原干細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗方法

          發(fā)布日期: 2013-08-29
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          實驗原理
          轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生促使我們理解成長和發(fā)展的各個方面了有了巨大的進(jìn)步。使用各種技術(shù)將一個單細(xì)胞胚胎植入到偽孕媽媽或用干細(xì)胞植入技術(shù)生成淘汰或基因敲除小鼠。這些實驗昂貴,勞動密集,費時和需要好幾個女的捐助者。精原干細(xì)胞是負(fù)責(zé)生產(chǎn)精子和合適的生殖轉(zhuǎn)換對象。Nagano等將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染精原干細(xì)胞,然后異種移植到雄性小鼠睪丸細(xì)胞后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。在某些情況下受體小鼠很難接受供體的精原細(xì)胞,其成功率是相當(dāng)?shù)偷摹M瑯樱瑪y帶lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒與睪丸生殖細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo),其成功率為2.8%。植入后的低成功率阻礙了胚胎植入。但是使用慢病毒的實驗,能提高其成功率。
          實驗試劑

          慢病毒pLKO.1 EGFP-F12。病毒滴度可以從 105~106 TU/ml

          麻醉劑:使用50mg/ml胺酮和20mg/ml二甲苯胺噻嗪鹽酸鹽的混合物,并用生理鹽水稀釋終濃度二甲苯胺噻嗪鹽酸9g/L,胺酮1.6g/L
          其他化學(xué)品:Tris-HCl,臺盼藍(lán)染料,十二烷基硫酸鈉(SDS),氯化鈉(NaCl),EDTA,蛋白酶K,多聚甲醛,甘油,氨芐青霉素(鈉鹽)和卡那霉素,以上試劑均購于公司;dNTPs 購于Promega公司;Taq聚合酶購于New England Biolabs公司。
          實驗設(shè)備
          動物麻醉系統(tǒng)(拉斯,型號901807VetEquip公司)
          光纖照明體視顯微鏡(尼康公司)
          PCR儀分光光度計
          UV-2450紫外可見分光光度計(島津公司)
          實驗材料
          試驗動物:任何品系的小鼠都可以使用。公鼠好選擇一月齡。本實驗選擇28-32日齡小鼠(CRLCFW),重約20-25克。
          動物飼養(yǎng):按標(biāo)準(zhǔn)配方和無菌水飼喂;環(huán)境溫度保持在23±20C;相對濕度:40-70%;光線:7:0019:00有光線; 19:007:00暗室。
          實驗步驟
          1. 制備高滴度pLKO.1 EGFP-F PURO慢病毒載體。
              1)將產(chǎn)生的 LVs,溶解于DPBS溶液。慢病毒的生物效價決定于受感染的不同濃度病毒稀釋的HEK-293細(xì)胞,病毒一般為105~106 TU/ml
          注意:
                  a. 病毒應(yīng)分裝保存在80,可以保存少1年且病毒滴度無明顯改變,在-80。如果病毒在一星期內(nèi)使用,可以儲存在4
                  b. 慢病毒能夠感染人體細(xì)胞。應(yīng)穿戴手套和防護(hù)服裝。避免泄漏和飛濺。慢病毒不穩(wěn)定,容易被乙醇,清潔劑或漂白劑溶解。任何泄漏或工作完成后,用乙醇或漂白劑消毒工作區(qū)。
          2. 體內(nèi)傳導(dǎo)所需的基因在睪丸
          注意:所有的動物實驗研究,應(yīng)按相關(guān)的指導(dǎo)規(guī)則,在相應(yīng)的權(quán)限和規(guī)定內(nèi)執(zhí)行。以下所有步驟應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行。
              1) 向日齡28雄性小鼠腹腔內(nèi)注射三溴乙醇(Avertin)(公司)(2,2溴乙醇和T-戊醇,按體重0.015ml/gm),關(guān)鍵步驟防止麻醉過量,不當(dāng)?shù)穆樽韯┝靠墒箘游镏滤馈?/span>
              2) 從小鼠腹股溝區(qū)剃毛和消毒。無菌條件下選擇陰莖前方,正中線皮膚切口,中央切口是的手術(shù)方法,一個切口取出兩個睪丸。
              3) 切開肌肉后,在彎夾鉗的幫助下剝離與腹腔睪丸連著的脂肪層。
              4) 使用30號針頭的注射器刺破睪丸組織,向睪丸間的管狀空間內(nèi)插入含臺盼藍(lán)染料(0.04%)LV30號針頭。添加臺盼藍(lán)監(jiān)測在刺入睪丸的準(zhǔn)確性。
              5) 向睪丸緩慢注入約10-20mL LV液。
          注意:每次注射后,等待30秒后拔出注射器以防止LV回流。注入DNA液的總體積不宜超過20μL,大量注射的慢病毒可能會使睪丸破裂。
              6) 將注射后的睪丸放回原位,由手術(shù)摘除對側(cè)睪丸,縫合內(nèi)部和外部的傷口。
          注意:在手術(shù)中,不摘除連同睪丸的脂肪或任何其他組織。要用無菌尼龍線結(jié)扎血管,防止出血,小心不要弄破睪丸。
              7) 在縫線的部位涂抹抗生素軟膏(新霉素和多粘菌素B硫酸鹽和桿菌肽鋅粉,Glaxo Smith Kline,印度),保持小鼠于熱板上約1h,麻醉中的動物容易蘇醒。
          3. 轉(zhuǎn)基因株系的建立
          注:在小鼠實驗中,它需要30天左右完成一個精子的周期:從精原細(xì)胞到精子。
              1) 注射后LV30天進(jìn)行交配,注射的動物與2個月齡的野生型(WT)雌性動物交配,幼畜出生后通常在22-30天交配。
              2) 3周齡鼠取尾2-3cm進(jìn)行活組織檢查,將其培育在他們在高鹽的消化緩沖(50 mM Tris HCl1SDS100mM NaCl100mM EDTA1200μg/ml蛋白酶K)中,55oC16h
          注意:將20mg蛋白酶K溶解于1mL無核酸酶水中。分裝蛋白酶K,并保存在-20°C任何凍融可能會使蛋白酶K的失活。
              3) 裂解分離DNA,酚氯仿萃取,乙醇沉淀。
          注意:苯酚和氯仿對健康造成危害,戴上手套和保護(hù)眼睛。

              4) 用紫外分光光度計檢查A260nm260nm / 280nm的比值定量DNA濃度的和純度。

              5) 稀釋DNA濃度200ng/μl和進(jìn)行PCR
          4. 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)篩選轉(zhuǎn)基因小鼠

              1) 準(zhǔn)備一個佳的反應(yīng)混合物體中: 1X Taq酶緩沖液,0.2mM dNTPs0.25µM上、下游引物, 0.06UTaqDNA聚合酶和20ng質(zhì)粒或200ngDNA基因組模板。混勻后短暫離心。Peltier Thermal Cycler PTC-200預(yù)熱液體后開始鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。(MJ Research, Minnesota, USA).

              2) 設(shè)置引物的PCR循環(huán)條件。根據(jù)1.5-2TAE瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。
          注意:每次PCR,野生型基因DNA和無DNA(模板)作為陰性對照,表達(dá)轉(zhuǎn)基因的純化質(zhì)粒作為陽性對照。
              3) F1代起,PCR陽性幼鼠應(yīng)與野生型雌性交配產(chǎn)生下一代。通過近親繁殖轉(zhuǎn)基因后代產(chǎn)生純代系。
           
           
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