實(shí)驗(yàn)步驟
選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎好，10-13天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。
1. 胚胎的分離
1） 適用哺乳動(dòng)物（倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠）
a.采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物
b. 立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用70%乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能，置紫外燈下照射5min。
c. 用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后退。
d. 用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，去除含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上
e. 剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌PBS的燒瓶中。
f. 漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直清洗液清亮為止。
2） 適用雞胚胎
a. 用70%乙醇擦洗雞蛋殼。
b. 用無(wú)菌剪刀輕敲雞蛋的圓端，輕輕去除蛋殼露出氣囊。
c. 用無(wú)菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。
d. 剪開(kāi)包膜，用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎。
e. 棄頭部，將無(wú)頭的胚胎置于廣口燒杯中，用PBS漂洗。
2. 將6-8個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移一個(gè)小的無(wú)菌廣口燒杯中，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎，用PBS漂洗。
3. 在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一500ml的無(wú)菌的有攪拌棒的燒杯中，加入200-300ml用HBSS配制的0.25%的無(wú)菌胰蛋白酶。
4. 在溫暖的環(huán)境中或置于37℃培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng)15min。
5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移一無(wú)菌大容積的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火胰蛋白酶。
6. 加入新鮮胰蛋白酶溶液（見(jiàn)前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中，重復(fù)步驟4和5。
7. 離心混合的細(xì)胞懸液，1200r/min，5min，棄上清。
8. 用新鮮的無(wú)菌PBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。
9. 用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直上清清亮為止。
10. 用含有10%牛血清和抗生素（如青霉素、鏈霉素）的DMEM 10ml再懸沉淀，并使終體積為100ml。
11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。可采用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞快。
12. 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入0.2ml細(xì)胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
13. 按每10mm平皿1*1074*107細(xì)胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中，在飽和濕度的37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育直細(xì)胞鋪滿。
14當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，去除培養(yǎng)液，用10%的溫暖的Versene（用PBS配制的0.53nmol/L EDTA），洗滌細(xì)胞層2次。
15. 棄Versene，加入相同體積的溫暖0.05%胰蛋白酶-EDTA。
16. 37℃孵育5min。
17. 用無(wú)菌吸管輕輕吹散細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移一含有1-2ml牛血清的無(wú)菌管中。牛血清的終濃度約為10%，起到中和胰蛋白酶的作用。
18. 離心，1200r/min，5min，棄上清。
19. 再懸沉淀于5ml培養(yǎng)液中，另加入15ml培養(yǎng)液，分裝于2個(gè)100mm平皿中。
20. 置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，直細(xì)胞長(zhǎng)滿，繼續(xù)步驟14-20以傳代細(xì)胞。
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