干貨知識！WB實驗的經(jīng)驗總結(jié)

發(fā)布日期： 2023-02-13

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　　WB實驗（蛋白免疫印跡實驗），是一項通過凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白，然后再利用特異性抗體識別這些蛋白的技術(shù)，它是對蛋白進行定性和相對定量的重要檢測方法。

　　盡管絕大多數(shù)研究僧在接觸該實驗時都會被虐的體無完膚，卻也在和WB斗志斗勇的過程中積累了不少經(jīng)驗。正所謂前人種樹，后人乘涼，現(xiàn)在中索萊寶就把前輩做WB實驗的經(jīng)驗總結(jié)起來，希望對大家能有所幫助。

　　一、關(guān)于蛋白提取：

　　1、裂解buffer：每種裂解buffer都有其擅長的用途，除了這些裂解buffer以外，為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的；在提取蛋白的時候僅僅靠裂解液有時候也不能達到完全抽提的效果，有條件的話，可以對抽提懸液進行10-20s的超聲破碎處理。

　　此外如果沒有裂解buffer，可以用1×SDSloadingbuffer代替來抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過抽提后的樣本不能進行濃度測定。

　　2、干擾蛋白：培養(yǎng)細(xì)胞、動物組織都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白與免疫球蛋白，這些蛋白會經(jīng)常性的出現(xiàn)雜帶干擾，一般白蛋白雜帶在70kDa處，免疫球蛋白雜帶出現(xiàn)在50kDa處。

　　建議廣大戰(zhàn)友在提取細(xì)胞蛋白的時候，一定要使用PBS漂洗細(xì)胞至少3次，去除殘留的培養(yǎng)基成分；提取組織的時候，盡量去除組織中血液的殘留，這樣樣本中的干擾因素才會減少到zui低。

　　二、關(guān)于膠濃度及電泳條件的選擇

　　正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區(qū)域分離開，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到zui低。

　　三、關(guān)于轉(zhuǎn)膜的條件與注意事項

　　1、轉(zhuǎn)膜條件：

　　對于分子量10-15kDa的指標(biāo)轉(zhuǎn)膜時間不宜過長，100V、冰浴45min足矣；對于分子量指標(biāo)150kDa以上的指標(biāo)，100V、冰浴2h也足夠了；其他介于15-150kDa之間的指標(biāo)100V、冰浴1h完全可以保證效果。

　　2、轉(zhuǎn)膜操作：

　　準(zhǔn)備PVDF膜的大小要與切割后的凝膠大小一致或略小，濾紙和海綿大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使膠變形，條帶彎曲，太薄氣泡容易進入，導(dǎo)致條帶不完整，這些都可以用增加減少濾紙量來改善。

　　一定要把目的蛋白分子量區(qū)域貼在膜的中間部位；分清楚正極與負(fù)極，避免反方向轉(zhuǎn)印；轉(zhuǎn)印緩沖液要提前預(yù)冷，整個轉(zhuǎn)印過程也需要在冰浴中進行。

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