免疫組化：細(xì)數(shù)那些年我們一起踩過的坑

免疫組織化學(xué)或者免疫細(xì)胞化學(xué)，是基于抗原-抗體相互識別作用，在光學(xué)顯微鏡的水平上利用抗體特異性結(jié)合，對組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原進(jìn)行定位的一種方法。目前該方法被廣泛地應(yīng)用于病理診斷及科研實驗當(dāng)中。小編這次和大家聊一聊當(dāng)年自己在科研生涯中踩過哪些免疫組化的坑？

一般來說，組織需經(jīng)過固定、脫水、包埋之后再進(jìn)行免疫組化染色，其中固定是踩坑的要任務(wù)，目前常用的交聯(lián)固定劑一般為甲醛類，但是不排除某些特定組織有特殊固定液（如昆蟲等）。如果組織固定不充分，極易造成抗原的聚集、彌散或者異位。小編就遇到過一次抗原異位，整張片子上分不出來哪里是陽性，像這樣。

邁過一個，緊接著我們來聊聊第二個坑，抗原修復(fù)。目前廣泛應(yīng)用的是熱修復(fù)和蛋白酶K修復(fù)，前者是利用加熱將醛基交聯(lián)的蛋白質(zhì)共價鍵打開，使得抗原表位暴露出來，后者是利用蛋白消化方法打開的交聯(lián)鍵，常用于容易脫片的組織。熱修復(fù)常用的兩種不同的抗原修復(fù)液：檸檬酸鈉pH 6.0和EDTA pH 8.0，兩種修復(fù)液的pH不同，導(dǎo)致后抗原暴露后恢復(fù)的構(gòu)象可能會有所差異。說到這里，大家可能很困惑，究竟要怎樣選擇抗原修復(fù)液呢？小編推薦給大家一條捷徑立即聯(lián)系購買抗體的制造商，如果實在無法獲得相關(guān)信息建議從用檸檬酸鈉pH6.0開始嘗試。

如果說運(yùn)氣足夠好，能夠成功跳過前兩個坑，第三個坑是一個隱藏的難點(diǎn)：一抗的孵育方式。大部分情況下，小編都會使用4度過夜的方式進(jìn)行孵育，但是偶爾鬧點(diǎn)小情緒，想要盡快的結(jié)束實驗，也嘗試過37度孵育一小時，不得不說，這種方法不僅時間短，背景色還很高呢。關(guān)鍵的是，不是所有抗體都適用于37度孵育一小時，小編的實驗生涯滑鐵盧之一就是預(yù)實驗的時候進(jìn)行4度過夜的方式進(jìn)行孵育，效果很好，正式實驗使用37度孵育一小時之后發(fā)現(xiàn)，沒有染色，結(jié)果不僅是重做還要被師姐熊。

說了這么多，其實只是冰山一角，前期封閉內(nèi)源性HRP，中間的血清封閉非特異性位點(diǎn)，后的DAB顯色鏡檢、蘇木素返藍(lán)都是事故多發(fā)地區(qū)。對于鮮少進(jìn)行免疫組化實驗室來說，更是難上加難。

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