文獻解讀|基于細胞膜靶向肽的增強型光動力學療法

迄今為止，腫瘤作為世界范圍內人類死亡的主要原因仍舊無法得到*的解決。許多科學家和研究人員在開發新型的腫瘤診斷與治療方面做出了很多努力與嘗試。光動力學治療（photodynamic therapy，PDT）是一種對正常組織侵襲性很小的腫瘤治療模式；治療過程中，輸送到腫瘤部位的光敏劑會通過定點光照激活，將氧氣轉化為細胞毒性的活性氧(ROS)，從而殺死腫瘤細胞。近些年來，在腫瘤治療中通過光動力療法（PDT）產生ROS，從而不可逆地破壞鄰近細胞的方式被廣泛采用。多肽基于其優異的生物安全性、潛在的生物降解性和多樣化的生物功能，在生物醫學領域，特別是腫瘤的診斷與治療，具有強大的體內應用潛力?；诙嚯牡男滦蜕锊牧贤瑫r繼承了多肽和傳統生物材料的優點，在開發并設計的腫瘤診斷治療策略中發揮著重要的作用。

 2019年10月3日，武漢大學化學與分子科學學院生物醫用高分子材料教育部重點實驗室張先正教授課題組設計了一種蛋白法尼斯基轉移酶（PFTase）驅動的質膜（plasma membrane PM）靶向嵌合肽PCPK，用于質膜靶向光動力治療（PM-PDT），并通過誘導腫瘤細胞質膜損傷及其損傷相關分子模式（DAMPs）的快速釋放而增強免疫治療。與檢查點阻斷劑anti-PD-1配合后，對轉移性腫瘤具有抑制作用。這種的PM-PDT策略通過誘導PM損傷及DAMPs的快速釋放能激活強大的抗腫瘤免疫響應，并引發抗腫瘤免疫反應，在免疫治療領域具有重要意義。該研究成果已發表在ACS Nano雜志，IF=13.903。博士生張馳、博士生高凡為共同一作者，張先正教授為該文章的通訊作者。

題目：

Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy

期刊：ACS Nano

影響因子：13.903

PMID：31566945

作者：武漢大學博士生張馳、博士生高凡為共同一作者

作者單位：武漢大學

索萊寶合作產品：

本文研究人員設計了一種蛋白法尼斯基轉移酶（PFTase）驅動的質膜（plasma membrane PM）靶向嵌合肽PCPK（PpIX-C6-PEG8-kkkkk-sktkc-OMe），用于質膜靶向光動力治療（PM-PDT），并通過誘導腫瘤細胞質膜損傷及其損傷相關分子模式的快速釋放（DAMPs）而增強免疫治療。PCPK的質膜靶向能力源自細胞的K-Ras信號傳導，該信號通路通過PFTase驅使相應的蛋白驅動到質膜。與光敏劑原卟啉IX（PpIX）結合，PCPK可以產生有細胞毒性的活性氧（ROS），從而使膜相關蛋白失活，引發脂質過氧化，并在光照射下以極低濃度（1μM）破壞質膜。特定的質膜損傷進一步誘導了DAMPs的快速釋放，導致抗腫瘤免疫反應比常規細胞質定位的光動力療法更強。當與程序性細胞死亡受體1阻斷療法聯合使用時，這種免疫刺激的質膜靶向光動力治療（PM-PDT）還表現出對遠處轉移性腫瘤的抑制作用。通過體外和體內實驗發現PCPK介導的PM-PDT較PCPK-SR介導的CP-PDT具有明顯的抗腫瘤作用。更重要的是，免疫分析進一步證實，PCPK介導的PM-PDT會導致DAMPs的快速釋放，導致比CP-PDT更強的免疫反應。這種的PM-PDT策略通過誘導PM損傷及DAMPs的快速釋放能激活強大的抗腫瘤免疫響應，并引發抗腫瘤免疫反應，在免疫治療領域具有重要意義。

靶向細胞膜（PM）的PDT（PM-PDT）結合PD-1檢查點阻斷療法*原發腫瘤并抑制遠端腫瘤的示意圖

1、PCPK和PCPK-SR納米顆粒的表征及體外ROS生成

PCPK和PCPK-SR在水溶液中通過靜電和疏水/親水作用自組裝成納米粒子（圖1A，B）。透射電子顯微鏡（TEM，圖1C，D）顯示PCPK和PCPK-SR納米粒子的粒徑分別為29.0 ± 3.8 nm和15.8 ± 4.3 nm，動態光散射（DLS）分析進一步證明了PCPK和PCPK-SR納米粒子的均勻粒徑分布（圖1E，F）。TEM圖像和DLS分析的結果均表明PCPK和PCPK-SR納米顆粒具有良好的分散性和均一的粒徑。如圖1G所示，由于自組裝納米結構π-π相互作用的存在，表明PCPK和PCPK-SR形成PpIX二聚體。而PpIX的引入賦予PCPK和PCPK-SR在光照下產生活性氧ROS的能力。本文利用ROS熒光指示劑DCFH-DA進行ROS檢測。圖1G顯示PCPK和PCPK-SR的熒光強度均隨著照射時間的延長而增加，并且兩者表現出相同的ROS生成能力。隨后又通過激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）在細胞水平檢測到ROS的生成。如圖1I所示，在沒有光照射的情況下，在PCPK和PCPK-SR組中均檢測不到綠色熒光。兩組的強烈綠色熒光表明光照射下，PCPK和PCPK-SR在細胞水平上都有ROS生成能力。

TEM圖像和DLS分析的結果均表明PCPK和PCPK-SR納米顆粒具有良好的分散性和均一的粒徑。PpIX的引入賦予PCPK和PCPK-SR在光照下產生活性氧ROS的能力，PCPK和PCPK-SR在細胞水平上都可以產生ROS。

2、研究PCPK和PCPK-SR的細胞PM靶向效果和滯留

評估了PCPK的細胞內法尼基化，并通過CLSM研究了4T1細胞的PM靶向能力（圖2A）。作為對照，屏蔽PCPK的巰基以阻止其法尼基化能力，并進一步研究了PCPK-SR的PM靶向能力（圖2B）。在與PCPK和PCPK-SR孵育6小時后，我們利用商業化的細胞PM追蹤劑（CellMask綠色質膜染色劑）標記細胞PM，并通過CLSM觀察了材料和細胞PM的共定位。如圖2C，D所示，PCPK的大部分紅色熒光位于細胞膜（細胞膜為綠色熒光），而只有一小部分紅色熒光在細胞質中被觀察到，主要是由于細胞吸收和溶酶體在短時間內被捕獲所造成。對于PCPK-SR組，由于阻斷了細胞的法尼基化過程，因此在細胞PM處累積的紅色熒光可以忽略不計。熒光共定位分析還顯示了PCPK的紅色熒光與細胞PM跟蹤物的綠色熒光之間有明顯的重疊，表明PCPK的PM靶向作用。然后用CLSM觀察4T1細胞與PCPK 或PCPK-SR分別在不同時間間隔(4、8、12 h)孵育后的熒光(圖2E,F)。圖2G顯示培養時間延長，細胞膜上紅色熒光增強，這是由于正在進行的PCPK介導的細胞內法尼基化和連續的細胞膜靶向作用所致。另外，PCPK-SR在細胞膜上的紅色熒光逐漸減弱，并隨時間逐漸消失（圖2H）。根據結果我們推測，靜電相互作用先介導了PCPK-SR對PM的靶向作用，然后由于PCPK-SR的吸收和排泄，PM靶向作用逐漸減弱和消失。

熒光共定位分析顯示了PCPK的PM靶向作用。細胞內的法尼基化可以驅動K-Ras衍生的嵌合肽PCPK靶向作用細胞PM。靜電相互作用先介導了PCPK-SR對PM的靶向作用，然后由于PCPK-SR的吸收和排泄，PM靶向作用逐漸減弱和消失。

3、體外細胞毒性和PM-PDT的療效及PM-PDT介導的細胞死亡機制

PM-PDT在細胞水平上表現出良好的治療效果。如圖3A所示，在660nm光照射（30mW/cm 2，60s）下，PCPK顯示出比PCPK-SR更高的細胞毒性。而光照下的PCPK顯示MDA濃度比不光照的組高6倍，表明脂質過氧化（圖3B）。如圖3C所示，在沒有光照射的情況下，PCPK和PCPK-SR組中的強綠色熒光表明PCPK和PCPK-SR的細胞毒性可忽略不計。但由于PM-PDT引起的細胞快速死亡，用PCPK光照射處理的4T1細胞顯示出明顯的紅色熒光和少量綠色熒光。這些結果表明PCPK可以通過PM-PDT破壞細胞PM并誘導快速細胞死亡。如圖3D表明 PCPK可介導細胞PM-PDT引起PM的破壞，而CP-PDT不足以引起細胞膜的破壞。將PI用作CLSM觀察的指標顯示光照射的PCPK組細胞PM也被破壞（圖3E）。通過凋亡和壞死分析研究PM-PDT對細胞的死亡機制。圖3F可以看出，PCPK-SR組一旦受到660 nm的光照射，CP-PDT就可導致早期細胞凋亡。同時，與PCPK孵育的4T1細胞在光照射后細胞明顯壞死。如上所述，PCPK具有強大的細胞PM靶向能力，而PM-PDT可以有效破壞細胞PM的完整性。因此，事實證明，PCPK介導的PM-PDT通過破壞細胞PM而引發細胞壞死。

PCPK可以通過PM-PDT破壞細胞PM并誘導快速細胞死亡。PCPK具有強大的細胞PM靶向能力，而PM-PDT可以有效破壞細胞PM的完整性。因此，事實證明，PCPK介導的PM-PDT通過破壞細胞PM而引發細胞壞死。

4、免疫功能

PCPK介導的PM-PDT可以選擇性破壞細胞PM，并誘導HMGB1和ATP等細胞內容物的快速釋放，從而進一步促進抗腫瘤免疫反應。PM-PDT通過誘導DAMP的快速釋放而表現出比CP-PDT更好的免疫刺激作用。

據報道，抗腫瘤免疫反應的激活將會伴隨著相關細胞因子的產生(如TNF –α、IL-6)和樹突狀細胞的成熟。本文研究人員通過皮下注射4T1細胞建立了BALB/c小鼠的4T1腫瘤模型，使用不同材料處理小鼠48 h后采集血清樣本，并通過ELISA方法檢測細胞因子含量，發現PCPK介導的PM-PDT可導致細胞因子的釋放高于其他，顯示了免疫應答的有效激活。

5、聯合化療與免疫治療的抗腫瘤效果

聯合PD-1治療時，由于高PM-PDT的功效和強大的全身性抗腫瘤免疫反應，PCPK對原發性和遠處腫瘤均顯示出更強的抗腫瘤作用。

6、流式細胞儀檢測遠處腫瘤中的腫瘤浸潤T淋巴細胞

快速釋放的DAMP，與PKPK-SR介導的CP-PDT相比，PCPK介導的PMPDT表現出更高的PDT效率并且可以引發更強的抗腫瘤免疫應答。

本文研究人員通過體外和體內實驗發現PCPK介導的PM-PDT較PCPK-SR介導的CP-PDT具有明顯的抗腫瘤作用。PCPK介導的PM-PDT會導致DAMPs的快速釋放，與檢查點阻斷劑anti-PD-1配合后,對轉移性腫瘤具有抑制作用。這種的PM-PDT策略在抗腫瘤的免疫治療方面具有巨大的應用潛力，在免疫治療領域具有重要意義。

文章題目：

Microneedle-Assisted Transdermal Delivery of Etanercept for Rheumatoid Arthritis Treatment    

PMID：31096705   

IF：4.773 

雜志名稱：

Pharmaceutics       

引用產品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit    

合作單位：

鄭州大學        

文章題目：

An anti-inflammatory peptide and brain-derived neurotrophic factor-modified hyaluronan-methylcellulose hydrogel promotes nerve regeneration in rats with spinal cord injury       

PMID：30705588    

IF：4.47    

雜志名稱：

International Journal of Nanomedicine       

引用產品：

SEKM-0143：Mouse BDNF ELISA Kit    

文章題目：

Antidiabetic effects of water-soluble Korean pine nut protein on type 2 diabetic mice    

PMID：31228801      

IF：3.7       

雜志名稱：

biomedicine & pharmacotherapy       

引用產品：

SEKM-0141：Mouse Insulin ELISA Kit    

合作單位：

哈爾濱工業大學    

文章題目：

Hydrogen gas reduces HMGB1 release in lung tissues of septic mice in an Nrf2/HO-1-dependent pathway       

PMID：30660872    

IF：3.361    

雜志名稱：

International Immunopharmacology       

引用產品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit  

SEKM-0007：Mouse IL-6 ELISA Kit    

SEKM-0010：Mouse IL-10 ELISA Kit    

合作單位：

天津醫科大學        

文章題目：

Eriodictyol Attenuates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through the Activation of JAK2    

PMID：29441020    

IF：3.2       

雜志名稱：

Frontiers in Physiology       

引用產品：

SEKR-0017：Rat CRP ELISA Kit    

合作單位：

濱州醫學院        

文章題目：

Immunomodulatory effects of collagen hydrolysates from yak (Bos grunniens) bone on cyclophosphamide-induced immunosuppression in BALB/c mice     

IF：3.19       

雜志名稱：

Journal of Functional Foods     

引用產品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit    

SEKM-0007：Mouse IL-6 ELISA Kit    

SEKM-0002：Mouse IL-1β ELISA Kit    

合作單位：

中國農業大學    

文章題目：

iTRAQ-based proteomic analysis explore the influence of hypoxia on the proteome of dental pulp stem cells under 3D culture

PMID：29327447

IF：3.106         

雜志名稱：

Proteomics         

引用產品：

SEKH-0013： Human IL-6 ELISA Kit     

合作單位：

重慶醫科大學      

文章題目：

Resveratrol exhibits an effect on attenuating retina inflammatory condition and damage of diabetic retinopathy via PON1     

PMID：30503749   

IF：2.998       

雜志名稱：

Experimental Eye Research       

引用產品：

SEKR-0002：Rat IL-1β ELISA Kit    

SEKR-0005：Rat IL-6 ELISA Kit    

SEKR-0009：Rat TNF-α ELISA Kit    

SEKR-0008：Rat IFN-γ ELISA Kit    

SEKR-0024：Rat MCP-1 ELISA Kit    

合作單位：

西安培華學院      

文章題目：

Evaluation and comparison of immunogenicity and cross-protective efficacy of two inactivated cell culture-derived GIIa- and GIIb-genotype porcine epidemic diarrhea virus vaccines in suckling piglets    

PMID：30827401    

IF：2.791     

雜志名稱：

Veterinary Microbiology       

引用產品：

SEKP-0010：Porcine IFN-γ ELISA Kit    

合作單位：

蘭州獸醫研究所