質粒DNA連接與轉化方法詳述

DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中有用的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；2、連接雙鏈DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。

目的DNA片段與載體DNA片段之間的連接方式（以T4DNA連接酶為例）主要有以下幾種：

（一）、具互補粘性末端片段之間的連接

大多數的核酸內切限制酶都能夠根據識別位點切割DNA分子，形成1~4核苷酸單鏈的粘性末端。當載體和外源DNA用同一種限制性內切酶切割時，產生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內切酶的識別序列；如果用兩種能夠產生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時，雖然可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。

（二）、平末端的連接

載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產生出互補的粘性末端。實際上有許多情況都是例外的，因為有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實驗要用兩種不同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA，形成的也多半是非互補的粘性末端或平末端；再如用機械切割法制備的DNA片段，PCR擴增的和化學合成的DNA片段或由RNA為模板反轉錄合成的cDNA片段，也不會具有互補的粘性末端。

理論上任何一對DNA平末端均能在T4DNA連接酶催化下進行連接，這給不同DNA分子的連接帶來了方便。但是，平末端連接更為復雜，且速度也慢得多，因為一個平末端的5’磷酸基團或3’羥基與另一個平末端的3’羥基和5’磷酸基團同時相遇的機會顯著減少，通常平末端的連接速度為粘性末端的1/10~1/100。為了提高其反應活性，一般選擇16℃較為合適。

外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，重組DNA分子必須導入適宜的受體細胞中方能使外源目的基因得以大量擴增或表達。隨著基因工程的發展，從低等的原核細胞，到真核細胞，進一步到結構復雜的高等動、植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適宜的受體細胞已成為重組基因克隆或表達的基本前提之一。

轉化方法：重組質粒DNA分子通過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程稱之為轉化（transformation）。細菌轉化的本質是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應遺傳性狀的過程。

以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉化的一種可能機制包括如下基本步驟：

（1）細菌感受態的形成；（2）轉化因子的吸收；（3）整合復合物前體的形成；（4）單鏈DNA轉化因子的整合；（5）轉化子的形成。

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細胞表面的結構和組成均與革蘭氏陽性細菌有所不同，自然條件下很難進行轉化，其主要原因是轉化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關系較遠的DNA分子更是如此。因此在大腸桿菌的重組質粒DNA分子的轉化實驗中，很少采取自然轉化的方法，通常的做法是采用人工的方法制備感受態細胞，然后進行轉化處理，其中代表方法之一是Ca2誘導的大腸桿菌轉化法。

Ca2誘導的轉化：細菌處于容易吸收外源DNA狀態叫感受態，用理化方法誘導細胞進入感受態的操作叫致敏過程。重組DNA轉化細菌的技術操作關鍵就是通過化學方法，人工誘導細菌細胞進入一個敏感的感受態，以便外源DNA進入細菌內。其原理是將處于對數生長期的細菌置于0℃，CaCL2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，同時Ca2 使細胞膜磷脂層形成液晶結構，使得位于外膜與內膜間隙中的部分核酸酶離開所在區域，這就構成了大腸桿菌人工誘導的感受態。

此時加入DNA，Ca2 又與DNA結合形成抗脫氧核糖核酸酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上。經短暫的42℃熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結構發生劇烈擾動，隨之出現許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內。 Ca2處理的感受態細胞，一般每微克DNA能獲得105～106個轉化子，環化重組子分子愈小，轉化率愈高，環狀DNA分子比線性DNA分子的轉化率高1000倍。