干貨|免疫組化的成功經(jīng)驗和失敗教訓，看這篇就夠了！

復雜的石蠟制片，繁瑣的脫蠟染色讓實驗的菜鳥們對免疫組化實驗望而卻步。每每做IHC時，每一步都小心翼翼，精益求精，等待掃描結(jié)果時，內(nèi)心總是獨白：“你已經(jīng)是一個成熟而的切片了，該展示你的精彩了”。但理想是美好的，現(xiàn)實是骨感的，總會遇到各種“疑難雜癥”，實驗還是得繼續(xù)摸索。究竟如何得到的免疫組化實驗結(jié)果，索萊寶為您歸納總結(jié)了一些常見問題和實驗小技巧。

  免疫組化（IHC）知識大講堂  

石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象怎么回事？

1）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

2）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以適當延長烤片時間和提高烤片溫度；

3）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等；

4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子要不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水；

5）展片沒有展開，撈片時有氣泡；

6）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。用含有多聚賴氨酸的玻片有助于粘附，索萊寶提供了多聚賴氨酸粘附載玻片。

組織切片為什么產(chǎn)生非特異性染色？

1）標本染色過程中干片會導致非特異性著色；

2）PBS沖洗不充分，殘留抗體會增強著色，應注重洗滌過程；

3）抗體孵育時間過長、抗體濃度高也易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。使用索萊寶推薦的稀釋比例對抗體進行稀釋。多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，也可以試用索萊寶的單克隆抗體；

4）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 

5）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果； 

6）DAB孵育時間過長或濃度過高。

為什么免疫組化染色呈陰性結(jié)果？

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤；

2）抗原修復不全。若微波效果不佳，還可高壓修復；

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應；

7）建議先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

為什么背景高？

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/span>

2）調(diào)整DAB孵育時間；

3）也要考慮血清封閉時間是否過短；

4）適當增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。

邊緣效應怎么辦？

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中。解決辦法：制備的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻？

1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一；

2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后要將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致；

3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你組化筆圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應。外側(cè)的組織片要離顯色液外緣0.5cm。

  免疫組化（IHC）的TIPS  

1. 組織固定越新鮮越好，盡快固定，多選用4%多聚甲醛固定液。但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液；

2. 組織脫水和透明時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整；

3. 切片展片時有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當?shù)卦谒屑尤霂椎我掖迹?/span>

4. 烤片：要控制烤片的溫度和時間，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失?？酒臅r候把切片呈60°角斜立，切片和載玻片之間的水滴或氣泡會從邊緣滑出，減少對切片的損壞；

5. 蠟塊及切片的保存：要在4℃保存；

6. 脫片問題：Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3min，晾干，即可進行下一步；

7. 滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活；

8. 暴露抗原：對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等；

9. 封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉；

10. 抗體稀釋：應遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用；

11. 背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗；

12. 顯色：DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

13. 返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍；

14. 整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。

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  此刻，相信您不會做不好啦  

  可是，但是，還是做不好怎么辦  

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