人粒細胞無形體病實驗室檢測方法

樣本采集對象
1. 人粒細胞無形體病病例（包括疑似病例，以下同）。
2. 病例密切接觸者或其他健康人群。
3. 疫源地可疑宿主動物（野生動物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。
標本種類及采集方法
1. 抗凝血。
常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應盡可能在病人使用抗生素前進行血液的采集。
2.非抗凝血。
用無菌真空管，采集病例、健康人群及宿主動物非抗凝血5ml，用于血清抗體及PCR檢測。采集后，應及時分離血清，將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測用血液采集盡可能在發病后1周內，恢復期抗體檢測標本采集少間隔2-3周。如第2份血清在1個月之內抗體升高不明顯的，應建議間隔2-4周后采集第3份血液標本。
3.包涵體檢測血涂片的制備。采集血液標本后，制作厚血片，進行紅細胞裂解處理等。
4.媒介蜱標本的采集。
采集動物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實驗室接到蜱標本后，先應進行種屬鑒定，然后按類別分組（1-5只蜱/組），采用75%酒精浸泡30min后，用無菌蒸餾水反復沖洗3次。后進行分組研磨，研磨液用于提取DNA，進行PCR擴增。
5.有條件時，可采集活檢或尸檢標本，冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進行實驗室檢測。具體方法參照病理實驗室相關要求和衛生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗規定》的相關要求。
人粒細胞無形體病實驗室檢測
（一）包涵體的檢測。
1. 血片及白細胞涂片制備
采集的抗凝血標本盡快用血球層推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白細胞并進行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。
2. 染色
通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏（Giemsa）染色法及瑞－姬混合染色法。有條件的實驗室，可使用美國CDC推薦的染色方法。
3. 染液配置方法
（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天搖勻１次，１周后可使用。
（2）改良Mc Donald法瑞－姬染色劑：75 ml甘油（分析純）中加入磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g），以4 ml蒸餾水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混勻，用濾紙過濾，保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞－姬染色劑50 ml，混勻后備用。
4. 染色步驟
血推片或白細胞涂片分別以兩種染色劑染色2 min，再加蒸餾水作用5 min，用自來水沖洗。
5. 結果觀察
中性粒細胞中可見桑葚狀包涵體（見圖1），并注意保存相關標本，以便進行復核。
（二）血清學檢測。
常用血清學方法為間接免疫熒光（IFA）法。采集急性期（發熱初期，一般發病1周內）與恢復期（少間隔2-3周）雙份血清。如恢復期血清抗體檢測陰性，應建議醫生采集第3份血液樣本（間隔2-4周）。
1. 試劑
使用推薦的、經過ISO質量認證的產品。
2. 方法及操作按說明書進行。
3. 結果解釋
IFA檢測結果解釋按說明書進行。
如果同時檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結果強烈支持嗜吞噬細胞無形體感染。如果急性期抗體升高，而恢復期沒有升高或輕微升高，則應采集第3份血液樣本（間隔2-4周）進行進一步檢測。
（三）嗜粒細胞無形體核酸PCR檢測。
目前，推薦使用16S rRNA基因檢測方法，有條件的實驗室，可進一步選用熱休克蛋白基因groEL擴增方法。
1. DNA提取
用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細胞及蜱研磨液提取DNA。后，以AE緩沖液50µl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細胞層提取DNA，可明顯提高陽性檢出率。實驗時，應采集當地正常人血液同時提取DNA，作為PCR的陰性對照。
2. PCR擴增
（1）16S rRNA基因檢測：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測常用的擴增靶基因，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應分區進行，避免污染。PCR反應混合物的準備按常規進行。*輪反應采用外引物對Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白細胞提取的DNA可適當減少）。PCR反應體系總體積為25µl或50µl（需要進行PCR測序或克隆時，應適當擴大反應體系），其它成分的濃度按常規進行。反應程序如下：
94℃ 5min
40循環：94℃ 45sec
55℃ 50sec
72℃ 1min
72℃ 總延伸 5min
第二輪反應使用2對引物分別進行巢式PCR。2對引物分別是無形體屬及埃立克體屬通用內引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測樣本取*輪產物1-2µl為模板，陽性對照取0.5µl為模板。反應程序同*輪反應。
（2）熱休克蛋白基因groEL擴增
與groEL基因的應用相比，16S rRNA基因的應用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。PCR檢測時，反應混合物的準備按常規進行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測。巢式PCR*輪反應采用外引物對HS1及HS6。
反應程序如下：
3循環：94℃ 1min
48℃ 2min
70℃ 90sec
37循環：88℃ 1min
52℃ 2min
70℃ 90sec
68℃ 總延伸 5min
第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測樣本取*輪產物1-2µl為模板，陽性對照取0.5µl為模板。反應程序同*輪反應。反應程序同*輪反應，但退火溫度由52℃改為55℃。