DNA產(chǎn)物純化常見問題

常見問題 
未回收或回收率低

可能原因  
膠塊未全部溶解 
建議解決方案 
溶解凝膠時(shí)應(yīng)該置于65℃水浴，不斷上下顛倒，確定膠塊*溶解后再進(jìn)行下一步操作。如果凝膠濃度較大，可增加溶膠液使用量。

可能原因  
 膠塊太大(>400mg) 
建議解決方案
如果需要處理的膠塊太大，應(yīng)該先將其切成小塊，做兩次回收或選用大量型回收試劑盒。

可能原因 
電泳緩沖液pH過高
建議解決方案 
硅膠膜在高鹽低pH值時(shí)可結(jié)合DNA，在低鹽高pH值條件下洗脫。如果電泳緩沖液pH值太高，會(huì)導(dǎo)致DNA無法結(jié)合或降低結(jié)合率，可在溶膠后加入3M NaAc (pH5.2)，將pH值調(diào)7.0以下。

可能原因  
漂洗液中未加入無水乙醇
建議解決方案 
*次使用之前應(yīng)該在漂洗液中加入無水乙醇。漂洗液每次用后應(yīng)該擰緊瓶蓋，以免乙醇揮發(fā)，降低回收率。

可能原因  
洗脫液不合適
建議解決方案
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水；洗脫液pH值過低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間，當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率。

可能原因  
洗脫液加入位置不正確 
建議解決方案
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。

可能原因  
洗脫體積太小 
建議解決方案
洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過200μl，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。

可能原因  
 洗脫時(shí)間過短 
建議解決方案
洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有—定影響，洗脫時(shí)放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。

 常見問題 
回收后的片斷無法用于后續(xù)試驗(yàn)，如連接等

可能原因  
 乙醇?xì)埩?nbsp;
建議解決方案
洗脫時(shí)硅膠膜上有漂洗緩沖液殘留，會(huì)使洗脫產(chǎn)物中含乙醇，影響下游操作，在洗脫之前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，*去除漂洗緩沖液中的乙醇。

可能原因  
 洗出液中污染有瓊脂糖
建議解決方案 
凝膠未全部溶解

可能原因  
 洗脫產(chǎn)物有ssDNA，表現(xiàn)為在瓊脂糖電泳上呈現(xiàn)小的彌散帶。
建議解決方案  
 將洗脫產(chǎn)物95℃加熱2分鐘，慢慢冷卻到室溫，使單鏈DNA重新退火復(fù)性即可。