DNA純化回收

DNA產物純化試劑盒簡介：
    對于TA克隆、酶切或者直接測序等試驗來說，純化PCR產物或酶切產物是非常必要的。以TA克隆為例，其成功率跟目的片段的純度高低有重要關系。雖然未經過純化的PCR產物也可以跟載體連接，但會增加篩選陽性克隆的難度，因為PCR產物中的dNTP和引物等可能也會跟載體連接。在進行連接試驗時，這些非特異性的產物會跟特異性產物相互競爭，從而導致連接效率下降。
 
DNA的片段純化回收原理
    在獲得DNA的片段后，一般采用吸附材料的方法去除雜質和純化DNA的片段。目前大多數生物公司都采用硅基質吸附材料，可特異性吸附核酸，有效去除體系中的蛋白、鹽類和有機物質。
 
DNA的片段純化回收的種類
    根據DNA的片段在待回收體系中是否為單一條帶，可將DNA的片段純化回收分為兩大類：直接純化和切膠純化。Solarbio公司針對這兩種純化方法開發出DNA產物純化回收試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒，可以滿足不同的試驗要求。
 
直接純化
    適用于有單一DNA的片段或溶液中所有DNA的片段都需要回收。對于一些下游試驗如測序、SNP分析等，需要從PCR或酶切產物中去除鹽離子、dNTP、 蛋白、 引物等雜質， 因為這些成分會抑制后續試驗的酶活性。
 
切膠純化
    適用于選擇性回收溶液中多種DNA的片段中的一種。對于后續試驗，采用切膠純化是有效的方法。通過瓊脂糖凝膠電泳可以分開特異性條帶和非特異性條帶，在紫外光下快速有效地切下目的片段所在位置的凝膠，然后通過進一步的純化就可以得到目的片段。 對于要求較高的后續試驗， 建議采用切膠純化的方法，這樣得到的片段純度比直接純化要高一些。
 
D N A的片段回收純化的一般流程：
一、反應液收集
PCR反應液
1、如要進行后續TA克隆，請選用能在擴增產物末端加A尾的聚合酶，如Taq酶或Hotstart Taq酶。
2、如對擴增序列保真度要求高，請選用具高保真擴增能力的聚合酶，如Pfu酶。
3、由Pfu酶擴增得到的PCR產物不帶A尾，如要進行基因克隆，可選用加A反應液對其添加A尾，從而保證克隆效率。
酶切反應液
1、酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶切反應。
2、雙酶切反應條件選擇可從兩種酶的反應溫度以及反應buffer來決定：從反應溫度考慮，應按照先高溫后低溫的順序進行；從反應buffer考慮，應按照先低鹽后高鹽的順序進行。
二、電泳檢測
    PCR或酶切反應結束，一般通過凝膠電泳檢測擴增或酶切結果。凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳普遍用于分離蛋白質及較小分子的核酸，瓊脂糖凝膠在分離同工酶及其亞型、大分子核酸等應用較廣。這兩種疑膠電泳是分離、鑒定和純化DNA的片段的標準方法。
 
瓊脂糖凝膠電泳
    瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、常用的分離純化和鑒定核酸的方法。根據瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖。低熔點瓊脂糖的熔點為62-65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態約數小時，主要用于DNA的片段的回收、質粒與外源性DNA的快速連接等。
    DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與瓊脂糖濃度、DNA分子量及構象、電泳緩沖液、 電場強度等因素有關。 一般來說， DNA的片段越大或瓊脂糖濃度越大， 其遷移速率越小； 而電場強度越高， 其遷移速率越大。分子生物學實驗中常用的電泳緩沖液主要有三種：TAE、TBE和TPE。TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE會導致DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀。TAE緩沖容量低，但價格較便宜，TBE緩沖液含有的EDTA可螯合二價陽離子，可抑制DNase活性，防止PCR擴增產物降解。
 
聚丙烯酰胺凝膠電泳
    聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體在催化劑TEMED和過硫酸銨的作用下聚合形成長鏈，并在交聯劑N,N’-亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳特別適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析，長度僅相差0.2％(即500bp相差1bp)的核苷酸分子即能分離。
    聚丙烯酰胺分辨率較瓊脂糖凝膠分辨率高，按性質可分為變性與非變性兩種。前者主要用于單鏈DNA的分離及純化，后者則主要用于雙鏈DNA的分離及純化。
 
核酸電泳指示劑
    核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭及二甲苯青兩種。溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6％、1％、1.4％和2％瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性DNA的片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1％和1.4％瓊脂糖中電
泳時，其遷移速率分別與2kb和1.6kb的雙鏈線性DNA大致相似。指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用有：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。
 
核酸電泳染色劑
    核酸電泳后，需經染色才能顯現出帶型，常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染法。1、溴化乙錠染色法：EB是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發下，發出紅色熒光。2、銀染法：銀染色液中的銀離子(Ag + )可與核酸形成穩定的復合
物。然后用還原劑如甲醛使Ag + 還原成銀顆粒。可把核酸電泳帶染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比EB高200倍，但銀染后，DNA不宜回收。
 
三、DNA片段純化
    根據電泳結果，確定待回收的DNA的片段在回收體系中是否為單一條帶后，可分別選擇不同的DNA的片段純化試劑盒。如果目的DNA的片段在回收體系中為特異的單一條帶，則可以選擇DNA產物純化回收試劑盒；如果在回收體系中的DNA的片段外還有其它非特異性DNA的片段，則需要選擇瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

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